高产油脂能源微藻筛选及其脱氮除磷与油脂积累的优化研究

微藻以其生长周期短、光合作用强、不占用农业耕地等优点被视为新型生物柴油的首选原料。然而产油效率低和生产成本高是制约微藻生物柴油大规模生产的关键问题。同时随着日益提高的环境要求,污水处理中的氮磷去除及资源的合理利用也已成为重要目标。利用污水培养微藻则可节省90%水资源和94%的氮源。同时在水资源方面可节省25%能量投入。微藻培养与污水处理的耦合,不仅可以降低成本,还可以净化环境,具有良好的经济效益和积极的环保意义。因此,本课题以高产油率和低成本为立足点,从利用藻类处理污水的源头入手,筛选油脂含量高、具有生产优良生物柴油品质能力的优势能源微藻,研究环境因素对其脱氮除磷性能和产油特性的影响,探索高产油脂能源微藻高效脂类积累,同时实现高效脱氮除磷的环境条件；揭示高产油脂能源微藻生长速率与氮磷去除效果和脂类物质积累之间的关系,阐明其在脱氮除磷过程中的环境适应机制。以期实现高产油脂微藻污水治理和生物柴油生产的统一。本文得到的主要研究结论如下：(1)评价了10株潜力微藻生产生物柴油的潜力。三角褐指藻(Phaeodactylum tricrnutum)由于拥有最高的油脂含量(61.43±0.95%)、最高的油脂产率(26.75 mg·L-1·d-1)、高C16-C18含量(74.50%)、高C16：1含量(22.34%)、高十六烷值(55.10)、低碘值(99.2 g12/100g)和相对较低的冷凝点(4.47℃),被最终选为优势能源藻株。为进一步评价微藻作为生物柴油原料的潜力,本研究将黏度、密度、十六烷值、浊点、碘值及热值这六个性质引入评定指标中,介绍一种依据脂肪酸组成快速评价微藻生物柴油性质的方法。从而可以轻易实现不同藻种的产油能力的比较,为最优藻种的选择和培养方法的优化提供依据。为保证优良的生物柴油性质,脂肪酸不饱和度范围应在0.2-1.4。(2)曝气对三角褐指藻的生长和产油有很重要的调控作用。考察三角褐指藻在7个不同气液比0、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5 vvm下的生长和油脂积累特性,结果表明三角褐指藻生长、产油和油脂生产的最优气液比是1.5 vvm,其比生长速率、生物量产率,脂肪酸甲酯含量和油脂产率分别为0.5 d-1、227.09mg·L-1·d-1、0.24% (DW)、48.48mg·L-1·d-1,优良的脂肪酸组分C16-C18脂肪酸含量为92.9%。气液比和比生长速率、油脂含量、脂肪酸甲酯含量的线性关系良好。此外,CO32-/HCO3-比例也对脂肪酸组份的合成有重要的影响,尤其是C16：1组分。另外,通过考察15℃,20℃,25℃及这三个温度之间每隔四小时的交替温度15-20℃,20-25℃,15-25℃对三角褐指藻生长和油脂积累的影响,研究了三角褐指藻在户外培养中的抗逆性。20℃为三角褐指藻生长和产油的最适温度,在20℃获得最高的生物量产率(98.64 mg-L·d-1)、油脂产率(24.66 mg·L-1·d-1)和脂肪酸甲酯产率(5.19 mg-g-1 DW)。温度交替波动对生物量影响不大,却不利于油脂的积累。三个温度交替时的油脂产率为20℃时的1/2,在恒温下,25℃更有利于油脂的积累。在三角褐指藻的光暗周期(Light:Dark=12h:12h)培养中,以全光照恒温20℃培养为对照,考察三组光暗培养下暗周期温度变化(Light 20℃:Dark 20℃),(Light 20℃:Dark 15℃), (Light 20℃:Dark 10℃)对三角褐指藻生长和产油的影响。结果表明,暗周期下低温有利于降低藻细胞生物量损失,且利于油脂积累。最佳生长和产油的光暗周期温度为Light 20℃:Dark10℃,获得平均生物产率58.52 mg·L-1·d-1,比光暗周期温度Light 20℃:Dark 20℃和全光照对照组提高了约1.6倍；藻细胞油脂含量在Light 20℃:Dark10℃下达到26.13%,平均油脂产率为15.29 mg·L-1·d-1,分别比Light 20℃:Dark 20℃和全光照对照组提高了约2.25和2.51倍。三角褐指藻生长的最佳pH范围为8.8-9.4,稳定末期的pH为9.6。(3)在山东省济南市泉城公园受污染湖泊中分离获得6株备选藻株。考察了这6株备选藻株的生长、油脂积累及脂肪酸组分情况,对这6株藻株产油潜力进行综合评价。两株藻株SDEC-6和SDEC-8由于具备高油脂含量、高油脂产率、高生物柴油产量和优良生物柴油性质被选为优势能源藻株。其中SDEC-6获得最高的油脂含量37.6%,SDEC-8获得最高的油脂产率13.52 mg·L-1·d-1, SDEC-6和SDEC-8获得最高的脂肪酸甲酯产率分别为11.7 mg·g-1 DW和9.55 mg·g-1 DW。通过透射显微观察、16SrRNA和18S rRNA基因序列分析(GenBank登录号分别为KU318705和KF999643),通过形态学与分子系统发育学分析,对获得的两株优势能源微藻(SDEC-6和SDEC-8)进行种属鉴定。SDEC-6命名为Cyanobium parvum SDEC-6; SDEC-8命名为Scenedesmus quadricauda SDEC-8.2株优势能源藻株已被保存到中国典型培养物保藏中心,保存编号分别为CCTCC NO:M2015769和CCTCC NO:M2014448。(4)根据典型城市生活污水中氮磷浓度配制三个不同氮磷浓度的废水,考察优势能源藻株C. parvum SDEC-6和S. quadricauda SDEC-8在不同氮磷浓度中的生长特性、脱氮除磷能力及油脂积累特性。结果表明：C. parvum SDEC-6和S. quadricauda SDEC-8可适应不同浓度氮磷废水并呈现出很好的产油和脱氮除磷性能。C. parvum SDEC-6在中浓度氮磷浓度废水b (TN:40 mg·L-1, TP:8 mg·L-1)中油脂含量可达到约30%,但在高浓度氮磷废水c (TN:85 mg·L-1, TP:15mg·L-1)中油脂产量最大,并获得最高的饱和脂肪酸含量、最高的生物量浓度和最高的脂肪酸甲酯产量。和其他蓝藻和绿藻相比,C. parvum SDEC-6显示出了更好的氮磷去除和产油优势,第5天时它达到最高的氮磷去除率和较高的油脂积累率,在中浓度废水b (TN:40 mg·L-1,TP:8 mg·L-1)中,氮磷去除率已分别达到84.76%和65.09%,油脂含量达到28.04%,此时油脂产率超过文献报道蓝藻的10倍以上。因此,C. parvum SDEC-6由于具备高氮磷去除速率、低培养时间和高产油率的特点,适合用来处理高氮磷浓度废水。S. quadricauda SDEC-8在三组不同氮磷浓度的人工污水中油脂产量波动不大,并能达到很高的生物量、油脂产率及高脱氮除磷率(第九天总氮去除率90%以上,总磷去除率60%-98%左右,在到达稳定期即第16天时,氮磷几乎完全去除)。在中浓度废水b (TN:40 mg·L-1, TP:8 mg·L-1)中,S. quadricauda SDEC-8获得最高的单不饱和脂肪酸含量(35.35%)、最高脂肪酸甲酯含量(59.57±0.02 mg·g-1 DW)和最高的脂肪酸甲酯产量(17.53mg·L-1·d-1).经过S. quadricauda SDEC-8处理后,三组废水出水可满足《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)一级A限值TN＜15 mg·L-1,TP＜0.5mg·L-1。在与其他报道相同的营养条件下,其脱氮除磷能力优于其他报道,产油能力也远优于其他藻种。因此,结合栅藻SDEC-8产油率高、产油质量高且可完全去除氮磷的特性,可用栅藻进行生活污水二级出水的深度处理。(5)根据优势藻株的不同特性,本研究利用校园污水来培养优势能源藻株C. parvum SDEC-6,并利用城市污水厂二级出水来培养优势能源栅藻Scenedesmus obliquus,研究了优势藻种在实际污水中氮磷去除和生长的动力学关系,建立了优势栅藻在二级出水中的生长和氮磷去除的动力学模型。提出了一个栅藻在废水系统中更有效去除氮磷和生产油脂的方法。结果表明：C. parvum SDEC-6在校园污水中适应力强,迅速生长,油脂含量达到26.8%,与人工配制校园污水中微藻生长和油脂积累效果相当,总氮、氨氮、总磷去除率分别为29.55%,41.17%,95.62%。其在校园污水中展现了更快的总磷去除率,第6天已实现90%以上去除。C. parvum SDEC-6在校园污水中饱和脂肪酸C16：0为69.10%,油酸(C18：1)作为生产生物柴油的最佳成分之一,含量为21.85%。校园污水中剩余的TN, NH4+-N和TP浓度与藻生物质浓度之间呈明显的线性关系,C. parvum SDEC-6在校园生活污水中消耗的氮源主要以氨氮为主,磷的限制最终导致低的比生长速率,而导致微藻对氮磷吸收变低,最终导致总氮和氨氮的低去除率。在二级出水中投加微量NaAC有效促进了栅藻脂肪酸甲酯即生物柴油的积累,投加20 mg·L-1 NaAC到二级出水,所获得的生物量产率和脂肪酸甲酯产率分别为28.61 mg·L-1·d-1和34.34 mg·L-1·d-1,这比未添加NaAC组相比,分别提高1.2倍和3倍。NaAC的投加不仅提高了生物柴油产量,还大大优化了生物柴油性质。投加20 mg L-1 NaAC时,微藻获得最高饱和脂肪酸含量177 mg g-1,单不饱和脂肪酸含量61.5 mg g-1,比未添加NaAC废水的单不饱和脂肪酸含量提高了3倍。城市污水厂二级出水中剩余的溶解性无机氮(DIN)和无机磷P04-P浓度与栅藻生物质浓度之间呈明显的指数关系。栅藻对磷有快速的吸附作用,而后利用细胞表面的磷支持生长。栅藻在二级出水中生物质浓度的提高主要是由于对硝态氮的利用。当氮磷质量比小于16时,比生长速率和氮磷比呈良好的线性关系,氨氮更有利于提高细胞生长速度,当氮磷质量比高于16时,磷限制是抑制栅藻细胞生长的主要因素。综合氮磷去除、微藻生物质积累、培养时间及经济成本等方面,在污水处理协同培养微藻的过程中,为实现最优生物量和超过90%的氮磷去除,通过模型提出在达到350 mg L-1的生物量时需保持每天12%的收获速率和8.33天的水力停留时间。