食品中罗丹明B的快速检测
胶体金免疫层析法（KJ201703）
1范围
本方法规定了食品中罗丹明B的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于辣椒粉和辣椒酱中罗丹明B的快速测定。
2原理
本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中罗丹明B经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，罗丹明B与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中罗丹明B进行定性判定。
3试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1试剂
3.1.1正己烷。
3.1.2丙酮。
3.1.3甲醇。
3.1.4磷酸氢二钠。
3.1.5磷酸二氢钠。
3.1.6提取试剂：将正己烷与丙酮按照体积比80:20混匀。
3.1.7复溶液：称取35.61g磷酸氢二钠(3.1.4)置于1000ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成0.2mol/L溶液A；称取31.21g磷酸二氢钠(3.1.5)置于1000ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成0.2mol/L溶液B。将溶液A与溶液B按照体积比67:33混匀，制成pH7.1磷酸盐缓冲液。
3.2参考物质
罗丹明B参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥98.6%
表1 罗丹明B参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
中文名称
英文名称
CAS登录号
分子式
相对分子量
罗丹明B
RhodamineB
81-88-9
C28H31C1N2O3
479.01
注：或等同可溯源物质。
3.3标准溶液配制
3.3.1罗丹明B标准储备液（1mg/mL）：精密称取适量罗丹明B参考物质（3.2），置于10mL容量瓶中，用甲醇（3.1.3）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/mL的罗丹明B标准储备液。冷藏，有效期6个月。
3.3.2罗丹明B标准中间液A（1μg/mL）：精密量取罗丹明B标准储备液（1mg/mL）（3.3.1）0.1mL，置于100mL容量瓶中，用甲醇（3.1.3）稀释至刻度，摇匀，制成1μg/mL的罗丹明B标准中间液A。临用新制。
3.3.3罗丹明B标准中间液B（100ng/mL）：精密量取罗丹明B中间液A（1μg/mL）（3.3.2）1mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇（3.1.3）稀释至刻度，摇匀，制成100ng/mL的罗丹明B标准中间液B。临用新制。
3.4材料
3.4.1固相萃取小柱：中性氧化铝柱，1000mg/6ml。
3.4.2免疫胶体金试剂盒（在2℃—8℃、干燥、避光条件下保存，在产品有效期内使用）。
3.4.2.1金标微孔。
3.4.2.2试纸条或检测卡。
4仪器和设备
4.1移液器：200μL、1mL和10mL。
4.2涡旋混合器。
4.3离心机：转速≥4000r/min。
4.4电子天平：感量为0.01g。
4.5振荡器。
4.6样品浓缩仪：如有需要。
4.7环境条件：温度：15℃—25℃，相对湿度≤60%。
5分析步骤
5.1试样制备
取具有代表性样品约500g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。
5.2试样提取和净化
准确称取试样2g（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，依次加入20mL提取剂（3.1.6），振荡提取3min，以5000r/min离心5min。上清液待净化。
吸取5mL提取剂（3.1.6）于固相萃取小柱（3.4.1）中，流出液弃去。将上清液全部转移至固相萃取小柱中，流出液弃去。再加入20mL提取剂（3.1.6）淋洗固相萃取小柱，流出液弃去。用5mL甲醇洗脱小柱，收集洗脱液吹干。精密加入500µL复溶液（3.1.7），涡旋混合1min，作为待测液。
5.3测定步骤
5.3.1试纸条与金标微孔测定步骤
吸取200µL样品待测液于金标微孔（3.4.2.1）中，抽吸5—10次使混合均匀，室温温育5min；温育结束后，将试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，室温温育5—8min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，进行结果判定。
5.3.2检测卡与金标微孔测定步骤
吸取全部样品待测液于金标微孔（3.4.2.1）中，抽吸5—10次使混合均匀，室温温育5min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5—8min，进行结果判定。
5.4质控试验
每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。
5.4.1空白试验
称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
5.4.2加标质控试验
准确称取空白样品2g或适量（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，加入100μL或适量罗丹明B标准中间液B（100ng/mL）（3.3.3），使罗丹明B浓度为5μg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
6结果判定要求
通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图1所示。
6.1无效
控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。
6.2阳性结果
检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中罗丹明B含量高于方法检测限，判定为阳性。
6.3阴性结果
检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中罗丹明B含量低于方法检测限，判定为阴性。
6.4质控试验要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。
7结论
当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。
8性能指标
8.1检测限：罗丹明B为5μg/kg。
8.2灵敏度：灵敏度应≥99%。
8.3特异性：特异性应≥85%。
8.4假阴性率：假阴性率应≤1%。
8.5假阳性率：假阳性率应≤15%。
注：性能指标计算方法见附录A
9其他
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。
本方法参比标准为SN/T 2430-2010《进出口食品中罗丹明B的检测方法》(包括所有修改单)。
附录A
快速检测方法性能指标计算表
表A.1 性能指标计算方法
样品情况a
检验结果b
总数
阳性
阴性
阳性
N11
N12
N1.=N11+N12
阴性
N21
N22
N2.=N21+N22
总数
N.1=N11+N21
N.2=N12+N22
N=N1.+N2.或N.1+N.2
显著性差异(χ2)
χ2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21)
自由度（df）=1
灵敏度（p+，%）
p+=N11/N1.
特异性（p-，%）
p-=N22/N2.
假阴性率（pf-，%）
pf-=N12/N1.=100-灵敏度
假阳性率（pf+，%）
pf+=N21/N2.=100-特异性
相对准确度，%c
（N11+N22）/(N1.+N2.)
注：
a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果；
b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。
N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。
C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。
本方法负责起草单位：山西省食品药品检验所。
验证单位：陕西省食品药品监督检验研究院、四川省食品药品检验检测院。
主要起草人：杨国伟、张烨、王媛媛、李倩。
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