内容目录
1. 术语表
2. 色素种类
3. 色素分化
4. 色素名称
5. 光强度、光质量与珊瑚色素表现色彩能力的关联实验
6. 青绿荧光色素
7. 讨论
8. 变色,褪色(色素白化)及颜色混合
9. 结论
这个月,我们要开始介绍有关光线(强度和光谱波段)与珊瑚颜色之间的关系。同时,我们还会引入一些其它研究的成果,包括令人迷惑的珊瑚色素(pigment)问题都将呈现给您。
一只珊瑚蟹正在紧张的守卫它的领土Pocillopora damicorni。注意,生长在活石上,具有红色荧光的藻类,珊瑚的青色和藻类的红色荧光合并在一起,形成橙色荧光。
本文所关注的与通常有关珊瑚颜色问题的研究有所不同,这是2008年最新的研究成果。这个成果是Alieva et al., 2008, D'Angelo et al., 2008, Feldman et al., 2008, Gruber et al., 2008, Vogt et al., 2008以及Oswald et al., 2007, Schlacher et al., 2007研究成果的总和,揭开了珊瑚颜色神秘面纱的一角,洞悉珊瑚色素的知识,以及告诉海友们在什么情况下可以控制和激发这些色素。
本文的目的是通过可视化的手段使大家识别特殊色素的光谱跨度,并使用分类方法根据光谱分类色素,从而便于创造光线条件以保持和激发更加绚丽的珊瑚色彩。
应该知道,保持和激发珊瑚颜色包括很多因素。光线自然是其中最重要的因素,但其它环境因素包括水流,ph值,碱度,营养盐含量等等都是不可忽视的。然而,当周围环境因素都达到要求时,光线却能够起到破坏或激发色素的不同效果。
在一定的条件下,光线能使色素发生呼啦圈扭曲效应(hula twist),使其产生或消退颜色,我们称之为着色(photoconversion)或退色(photobleaching)。当光线强度或光谱波段下降到某个水平以下,色素细胞开始放松,达到一般状态。
有时,光线会完全破坏色素细胞,导致珊瑚不可逆转的变色。
本月,我们检视色素分支及光线的强度和光谱范围对青(蓝绿,cyan)色素的影响。在开始正文之前,先向大家介绍一些术语。
术语表
以下术语将会在文章中遇到:
吸光率(Absorbance):
物体或溶液表层保留而不反射或传输光的能力。
吸收(Absorption):
某些光辐射被保留而不发生反射和传输的过程。
明亮度(Brightness):
发射荧光的强度。消光系数*时间量子产能=明亮度
分化枝(Clade):
文章中所提到的一些色素是从同一种色素分化而来,有许多相似的特性。珊瑚体内的色素包括分化枝A,B,C,D。分化枝与活着的生物体有关如:(clades of Symbiodinium - zooxanthellae - are a good example.)
载色体(Chromophore):
色素细胞中发色的部分。有时载色体也指包含许多色素细胞的核状物。
色素蛋白质(Chromoprotein pigment):
一种无荧光色素。这种色素有颜色是因为它能反射光线。例如最大吸收波段为580nm(纳米)的色素蛋白会呈现紫色,因为它优先反射蓝色和红色光波。
Chromo-Red Pigment:
一种具有色素蛋白和Ds-Red荧光色素蛋白双重特性的色素。能产生609纳米的超强红色荧光。
青色荧光蛋白,Cyan Fluorescent Protein :
能发出477-500纳米范围内的荧光。青色和绿色有相似的载色体结构。青色素荧光效果比绿色素,红色或无荧光色素的颜色弱。
荧光(Emission):
在激发光线照射下,荧光色素释放的光线。
消光系数(Extinction Coefficient):
在特定条件下,蛋白质吸收光能。
激发光(Excitation):
被荧光色素吸收的光线。激发后会释放出波长较长或能量较低的荧光。
Ds-Red type pigment:
一种荧光波段集中在574-620纳米之间的红色荧光色素。Originally found in the false coral Discosoma.
荧光性(Fluorescence):
物质能够吸收一种波长范围或一种颜色的光线,然后发出另一种波长范围或颜色光线的特性。吸收过程也被叫做激发,激发光源消失后,荧光会在极短的时间内消失。
绿色荧光蛋白,Green Fluorescent Protein (GFP):
能发射波长在500-525纳米范围内的荧光蛋白。
呼啦圈扭曲效应(Hula Twist):
色素细胞分子之间的化学键并未断裂,但颜色发生了明显变化。因此,色素的颜色可以来回转变,使人联想起呼啦圈舞动的颜色变化。
Kaede-type pigment:
一种红色荧光色素,能发出574-580纳米的荧光,二次激发情况下能够发出630纳米的荧光。最初是在硬骨珊瑚Trachyphyllia geoffroyi上发现了这种色素,但在Faviina的亚目中该色素更为常见。
Kindling Protein:
一种能从无荧光效果的色素蛋白转化为具有荧光效果的色素蛋白质。有时被称为“Kindling Fluorescent Protein”或“KFP”
量子产额(Quantum Yield):
激发光被吸收转换成荧光的产能。如果100个光子被吸收,50个光子作为荧光释放,量子产额就是0.50。
退色(Photobleaching):
有些色素,如Dronpa,在暴露在强光下会失去荧光(开始会变成绿色,最后在蓝绿色光下失去荧光)。退色会明显影响生物表明荧光性。多种色素都存在消退荧光的现象,最后导致表面颜色明显变化,甚至白化。
变色(Photoconversion):
在光线的作用下,有色蛋白内部结构重新组合。根据蛋白的不同,变色也分为荧光增强和荧光减弱(增色或退色)。变色过程中,蛋白分子内部化学键变化,(as with Kaede and Eos fluorescent pigments)可形成永久变色或随光线变化而变色的呼啦圈扭曲效果的临时变色,就是大家常说的变色反应)。
红色荧光蛋白,Red Fluorescent Protein (RFP):
能够发出570纳米或波长更长荧光的荧光蛋白。包括Ds-Red, Kaede以及Chromo-Red pigments.
斯托克司频移(Stokes Shift):
激发光最长波长与荧光最长波长之间的差值。例如激发光最长波长508纳米,而发出荧光最长波长538纳米,斯托克司频移为27纳米。
激发临界值(Threshold 或 Coloration Threshold):
荧光物质被激发出明显可见的荧光时的临界值,或无荧光物质吸收光线的临界值。临界值一般与荧光产生有关,有时也用于判断荧光效果是否消失。(在判断退色和变色中使用)
黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescent Protein):
一种不常见的荧光蛋白,能发出525-570纳米的荧光。(Alieva et al., 2008).
色素分类:
目前至少发现了9种珊瑚色素。某种红色或绿色可能在结构上与其它红色或绿色分支不同,包括:
检验色素的分化情况好像没什么意义,不过还是有些有用的信息。我们假设色素分化已经进行了上千年,每种分化枝内部都会有单独的特定性,我们可以利用这些分化数据,与其它数据结合,形成一个粗略的表格,理解色素是如何表现出各种色质,包括光线和其它的可能因素。很有趣的是,有些色素是在某种生物的体内完成进化的,(分支 A 在海葵中, 或者分支D的Kaede-type 色素绝大多数在硬骨珊瑚Faviina的亚种中进化。
下面的表格1-4列出了各种色素的名称速记。因为通常研究人员只列出给定的色素名称,如 mcav4, Eos, or r1.2等,而没有提供更进一步的信息,表1-4是为了我和大家都使用方便,尽管有些研究中使用的名字可能会有些差别,但我想大家会从中受益的。
目前有4个主要分支,其中分支C有很多亚种。咱们从分支A开始:
Clade A
完全由海葵(Actinaria genera)色素组成,其中包含各种绿色和红色荧光色素,除此之外还有些色素蛋白质,不包含青色或黄色荧光色素。表格1,证据现实,在分支A中,变色是可能发生的,尤其是在Anemonia sculata 内部的kindling' protein,色素蛋白质转变成荧光蛋白色素是可能的。(在强光条件下,从吸收最大波长562纳米的色素蛋白质转变成能发出595纳米荧光的色素蛋白。)
表1 Clade A 包含各种绿色和红色荧光色素,除此之外还有些色素蛋白质。还包括Anemonia sculata内的kindling protein。关键字: Non-fluorescent protein (Chromoprotein); DsRed-type protein (DsRed); Green Fluorescent Protein (GFP).
Clade B
分支 B 主要是硬放目色素蛋白质(包括在Acropora, Montipora, Pocillopora, 等等),3种红色荧光色素(来自于硬骨珊瑚Porites, Montipora, 以及the false coralDiscosoma),还包括一种青色荧光色素。目前,分支 B 还不包括任何绿色或黄色荧光色素。表2 在分支B中变色经常发生,青色荧光色素除外。
表2 分支 B 包含所有的Acropora 和 Montipora 色素蛋白质,(还包含其它种类) 以及许多Ds-Red type 荧光色素。关键字: Non-fluorescent protein (Chromoprotein); DsRed-type protein (DsRed); Cyan Fluorescent Protein .
Clade C, 包含 C1, C2, and C3
这个分支是目前最复杂的,包含一部分青色、绿色、黄色以及红色荧光蛋白色素,还有一种无荧光有色色素蛋白(red pocilloporan来自于硬骨珊瑚Stylophora pistillata)。 绿色荧光蛋白大多来自于Acropora 和 Montipora 种类,也有一些来自于 Meandriina, Fungiina 和 Faviina。见表3。
Taxon Pigment Name Type of Pigment Order/Suborder Excitation Emission Clade
表3 分支 C 有三个亚分支(C1, C2 and C3)总和一共4个主要类型,包含所有荧光:青色、绿色、黄色和红色。关键字: DsRed-type protein (DsRed); Cyan Fluorescent Protein ; Green Fluorescent Protein (GFP); Yellow Fluorescent Protein (YFP).
Clade D
这个分支内的所有色素都有一点荧光,而其包括 Ds-Red 和 Kaede-type 橙色/红色荧光色素蛋白。 分支 D 包含的色素至少来源于两种软珊瑚(Clavularia 和 Dendronephthya species),false corals (Discosoma and Ricordea)和许多硬骨珊瑚。这一分支中的许多色素都有变色的可能。其中一种绿色荧光色素 Dronpa 暴露在强烈的蓝绿光下会发生退色。有趣的是,这些色素却来自于硬骨珊瑚Faviina的亚种。见表4。
表4 分支 D 只有荧光蛋白。 它们是青色、绿色和两种红色(Kaede and Ds-Red) 的色素。 关键字: Cyan Fluorescent Protein ; DsRed-type protein (DsRed); Green Fluorescent Protein (GFP); Kaede-type Fluorescent Protein (Kaede).
最近的研究(D'Angelo et al., 2008)报告了光强度与各种珊瑚荧光色素和无荧光色素蛋白成色品质关系的实验数据。实验中使用的小水螅体硬骨珊瑚为Acropora millepora, Acropora pulchra, Hydnophora grandis, Montipora digitata 以及 Seriatopora hystrix。 好像之前排版中将一些色素的标签弄错了,但至少有11个珊瑚色素是绝对没问题的 (4 个青色荧光色素,3 个绿色荧光色素,1 个橙色荧光色素和1个红色荧光色素。两个无荧光色素蛋白)。
珊瑚着色表现是通过光子通量密度这个参数来衡量的(光子通量密度PAR值分级为,非常低 (80 µmol·m²·sec),低(100 µmol·m²·sec) ,中等(400 µmol·m²·sec), 和高(700 µmol·m²·sec))。光周期为12小时。在使用蓝色光谱实验中,金卤灯提供了小于50%的可见光照射。在接下来的讨论中可以看到光子通量密度与水族箱内生物的关系。
试验中采用商用可见光滤镜,将金卤灯的光分为3个类别。图片1中表示了大致的滤镜分离光谱的效果。
图片1。使用滤镜将金卤灯光分大致分为3个波段的光谱。D'Angelo et al. (2008).
遗憾的是,我们还不知道使用的金卤灯的详细信息。我们只知道该金卤灯是水族专用的,将近50%的光谱是偏蓝色的。金卤灯是kelvin 牌等。如果了解更多的信息,我们就能够更加清楚评估其为水族箱内珊瑚提供照明的效果了。因为金卤灯能够提供较为广泛的光谱,因此我们希望滤镜能够将光谱限制在一个较小的波长范围内。至于其它的信息,通过email没能与试验者取得答案。
当使用蓝、绿和红色滤镜时,研究人员将光子通量密度调整到200 µmol·m²·sec,但要知道,绿色滤镜同样允许蓝色光穿过(占总同光率的25%, 绿色滤镜通过的蓝光至少50 µmol·m²·sec )。红色滤镜滤光效果非常精确。
D'Angelo等人的实验结果提供了关于光照强度和光谱范围对珊瑚着色影响的意想不到的结果。有些色素只需要一点点激发,而有些荧光色素则需要光线达到一定的临界值。至少有一种色素在光线逐渐增强的条件下其浓度呈现了减少的趋势。基于同样的原因,珊瑚虫生产色素是根据不同光线改变的,每种色素对不同颜色光线的反应是不同的。
根据我们的定义,青色Cyan (这个英语单词源于希腊语,意思是较暗的蓝色) 色素是指荧光光谱达到500纳米的色素。
图2。 一种尚未识别的Acropora 种类,显示出了青色(蓝绿色)的荧光。色素很有可能属于分支C2 。 Photo by the author.
图3。 漂亮的偏蓝色荧光,来自Discosoma specimens。色素很有可能属于分支B。
图4。Montipora danae (the 'Superman' Montipora)发出的偏蓝色荧光。色素可能属于分支C3。橙红色荧光波长应集中在611纳米,分类还不清楚。Photo by the author.
表5。青色色素列表,包括生长该色素的珊瑚信息,种类,激发光和荧光灯,还有可以确定的色素分支信息。这里,可以肯定,来自于青色Acropora 和 Montipora 的色素分别属于色素分支C2和C3。
青色荧光色素 483,CFP483
Acropora pulchra 上的青色荧光色素是由D'Angelo 和他的同事们发现的,当时的激发条件是中等强度的光,400 µmol·m²·sec。增加光强度并没有增加青色荧光。当光强度减弱到80 µmol·m²·sec and 100 µmol·m²·sec ,CFP483 也是一种重要的,稍弱些的荧光。见图5。在他们的光谱波长范围实验中,研究人员发现,绿光和蓝光激发该类色素产生荧光效率更高,单独的红光照射也能提升这些色素发出荧光的效果。(见图6)
图5。金卤灯照射下,光线强度对青色荧光色素483的影响效果。
图6。不同颜色激发光下青色荧光色素483的表达效果。光强度均为200 µmol·m²·sec
青色荧光色素,CFP484
这个色素还是发现于Acropora species体内 (尤其是 A. millepora – 见图片7)反应与 CFP-483 有所不同。
图7。Acropora millepora.的青色荧光色素,在红光下拍摄。 Photo by the author.
D'Angelo 及她的团队发现,这种特殊的色素在光线强度从80 µmol·m²·sec 升高到100 µmol·m²·sec 再到 finally 400 µmol·m²·sec过程中不断增加。当光线强度增加到700 µmol·m²·sec时,荧光效果开始减弱 (见图8)。 红光在产生色素的过程中效率较低(见图9)。
图8。金卤灯照射下,光线强度对青色荧光色素484的影响效果。
图9。不同颜色激发光下青色荧光色素484的表达效果。光强度均为200 µmol·m²·sec
青色荧光色素 486,CFP486
众所周知,Montipora digitata 的各个种类颜色非常多,还有多色的品种。图10及图11分别说明了色素产生于光线强度和光谱范围的关系。
图10。光强度对CFP486产生的影响。
图11。不同光谱对CFP486发射荧光的影响。光线强度均为 200 µmol·m²·sec
青色荧光色素 492,CFP492
硬骨珊瑚Hydnophora grandis 含有这种色素,见图片12.在低光密度80 and 100 µmol·m²·sec的条件下,荧光反应就能增强到最大值400 µmol·m²·sec,当激发光强度达到700 µmol·m²·sec时,荧光开始减弱,见图13。 当分别检验其对蓝、绿和红光的反应时,红光下尽管也能发出大量荧光,但比起蓝色和绿色的激发效率,还要稍逊一筹,见图片14。
图片12 Hydnophora specimen上发出的绿色荧光 Photo by the author
图片13 光强度对CFP492荧光反应的影响。
图14 光强度在200 µmol·m²·sec 条件下,各种不同颜色的光对CFP492荧光反应的影响。
青色荧光色素 497,CFP497
CFP497与其它色素不同,它对光强度和光谱范围都很敏感。Acropora millepora 中的CFP497在100 µmol·m²·sec 的光线强度照射下产生速度最快,在光线强度达到400 µmol·m²·sec才开始出现缓慢的减少。有趣的是,它的荧光反应在光线强度低于80 µmol·m²·sec 或高于700 µmol·m²·sec时几乎微弱到没有,见图15。
尽管红色光线能稍稍提升色素的产生速度,绿光和蓝光却更能提高该珊瑚的色彩。见图16。
图15。光强度对色素CFP497形成的影响。
图16。不同颜色的激发光对CFP497产生荧光效果影响的比较。光密度均为200 µmol·m²·sec
在开始讨论各种青色荧光色素对光强度和光谱范围的反应之前,我们需要把D'Angelo 及她的工作小组使用灯光的强度给大家一个概念性的认识。
会议一下刚才提到的灯光强度分类:非常低(80 µmol·m²·sec), 低(100 µmol·m²·sec)中等 (400 µmol·m²·sec)和高(700 µmol·m²·sec),光照时间12小时。应为光照周期为12个小时或接近这个数值是广大鱼友普遍的选择,因此,我们不必为此多虑了。倒是光的强度,要仔细审视一下。如果光的强度非常重要,我们不禁要问:
一般的灯光强度应该是多少,400 µmol·m²·sec 在水族箱条件下可以吗?
为了回答这个问题,我参与了全国范围的水族光线强度测量调查。包括使用的各种光线系统 (如金卤灯,荧光灯,PC等等或组合形式)。测量是在水族箱内接近珊瑚处进行的,于是我们对于水族箱内的光线强度有了明确的认识。见图17。
图17。水族箱内珊瑚周围光线强度的测试。
正如我们看到的,家庭水族箱内光线强度达到80 µmol·m²·sec或100 µmol·m²·sec是非常容易的。 然而,要达到400 µmol·m²·sec 绝非易事,因为只有不到13%的接受测试者达到或超过了这个值。只有不到1%的接受测试者达到了D'Angelo试验中的700 µmol·m²·sec高强度值。当参考以下信息时,你应该了解上述统计的数据。
同样,我们还要回顾一下试验中使用的光谱范围。回顾时,我们发现并不知道确切使用的是什么灯光,(只知道是偏蓝的金卤灯)。总比光谱中包含全部蓝、绿红滤镜要好,因为我们不使用滤镜。
大多数青色荧光色素在400 µmol·m²·sec 光线下,荧光效果最强烈。(要知道,实验中使用的灯泡有将近50%的光谱是蓝光范围,建议使用kelvin灯泡),遗憾的是关于灯泡品牌的调查没有音讯。这些色素包括CFP483 (from Acropora pulchra), CFP484 (from Acropora millepora), CFP486 (from Montipora digitata), and CFP492 (from Hydnophora grandis)。
来自Acropora millepora青色荧光色素CFP 497具有不同的特性,当暴露在100 µmol·m²·sec强度的光线下,荧光效果最强烈,而暴露于700 µmol·m²·sec强度的光线下,完全没有了荧光。
在每个例子中,红色光谱能够提升色素细胞的最低数量,然而,但激发光线在200 µmol·m²·sec 条件下,荧光表现明显不同。例如,Montipora digitata 的青色荧光色素 CFP486在红色光线下,是在蓝光条件下发现数量的50%。相似的情况,Hydnophora grandis 的CFP492在红光下发现的数量仅为在蓝光下的40%。在所有的实验中,色素在红光条件下展现出来的数量大约是在蓝光条件下数量的10-15%。
珊瑚通常具有多种荧光色素。( Favia 的一种被发现有十余种色素)各种色素作用混合在一起形成了我们所看到的珊瑚的颜色,我们把这种效果叫做颜色混合。色素颜色增加(荧光效果增强或转化), 变化 (变色) 或消退(褪色白化或荧光效果减弱)对于珊瑚的外表颜色有着甚远的影响。图18说明了根据光线强度描绘了这种可能性。想象我们使用某种特殊的波段的光线照射珊瑚并观察它们的荧光表现,你可能猜不出结果,但这只是个简单的例子。
图18。曲线表示CFP484 和CFP 497在光线强度增强时荧光效果减弱。然而色素512 和色素605的荧光效果却在增加。在光线强度在80 µmol·m²·sec的条件下,珊瑚会呈现蓝绿色,即青色偏绿,直到绿色和红色色素在700 µmol·m²·sec光线强度下占据主导。这是变色的一种情况吗?光线强度的变化使得色素内部化学结构发生变化从而转换荧光颜色吗?还是一个色素褪色褪色的过程(CFP484 和CFP 497),光线强度诱导荧光(色素 512 和 605),或者两者兼而有之?
青色荧光色素变色的记载很少。其中两个属于分支A(Condylactis gigantean 496 纳米转变成一种未识别波长,Anemonia sculata 499 纳米转变成522 纳米以及 Acropora secale's 青色素从484纳米转化为绿色515纳米。图片18-20有更多的信息。
图片18 光线(尤其是蓝光) 包含了一个荧光转变,从青色(484 nm)到绿色( 515 nm)
图片19 分支A中的一个色素,光谱使其发生变色是可能的。
图片20 双激发峰值,要观察从一个激发峰值到另一个。(499 纳米到522 纳米,也就是从青色到绿色。
光的强度和光谱范围对珊瑚的显色起着十分重要的作用。当然这不是唯一条件,只有在水质等其它参数都很稳定适合的情况下,才成为决定性的因素。
D'Angelo 和她的小组使用的光强度分级方法明显与自然珊瑚吸收性有关。令人惊讶的是,当我进行水族箱内实际光线测量并分类时,竟然惊人的一致。见图17.以下是我的分类:
注意,中高等的灯光一般来自于光照强度高灯泡直接照射小区域。因此在摆放很有青色荧光色素的珊瑚时,最好使用测光表先测量一下。这里有关于光强的转化的文章 (www.advancedaquarist.com/2008/2/review) 这里有相关的廉价测光产品 (www.advancedaquarist.com/2005/7/review).
要搜集11年来收集的光照数据需要很长时间,但我要在这个系列文章结束前整理好。
大多数青色荧光色素显色最佳光照强度在400 µmol·m²·sec左右,(Acropora millepora例外,CFP497在100 µmol·m²·sec到达峰值)。
当我们检验光谱对色素的效应时,几乎所有的例子中,蓝光激发荧光的效果最有效。绿光次之,尽管绿色滤镜会通过一些蓝光。红色滤镜滤光效果最好,最精确,但红光在刺激色素细胞方面效率最低。灯光的光谱信息还有待进一步检验。
总而言之,能够刺激珊瑚显色的光线强度不难达到,尽管显色的临界值范围比较狭小。更重要的是,要激发和保持珊瑚青色颜色,光谱范围其实并不那么敏感,(尤其是红光),还有些色素将会在其他文章中讨论。目测水族箱内的珊瑚就知道,它们支持这个结论,青色在人造光线下比较容易合成和显色。
红光的负面影响在长时间照射情况下,尤其是超过30天或更长时会比较明显。本文中,红色光线明显不能像蓝、绿光一样刺激珊瑚显色。我们在2008年12月份中已经讨论过红光对珊瑚的生长的作用,这是文章链接www.advancedaquarist.com/2008/12/aafeature1
将珊瑚色素进行分支归类也是一个很重要的步骤。之前我们常用激发光分类色素,尤其是根据荧光。 当时我们还不能说这个分类中的色素会和其他分类中的色素在相同条件下有什么反应。我们开始归纳,现在,可以通过分支系统这个重要更具理解荧光色素的产生和保持。
我正在研究一种低成本的珊瑚色素分类方法,如果成功,我会在将来的文章中发表。
那么本期的荧光色素就谈到这儿,下个月,我们着重谈绿色荧光色素以及光线强度和光谱范围是如何刺激和抑制色素的。将来的文章会着重谈橙色和红色荧光蛋白,本系列文章会以在许多珊瑚中发现的色素蛋白问题结束。下面有相关的全部参考文献。
如果您有疑问?有任何评论?请发到我的电子邮箱 RiddleLabs@aol.com.
联系客服