高浓玉米秸秆碱法预处理及半同步糖化发酵生产乙醇的工艺研究
连战，吕志飞，刘彬，刘欣，李乔丹，田冰，庄倩倩，刘同军*
(齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院，山东 济南，250353)
摘 要 为实现玉米秸秆高效转化可发酵糖，提升玉米秸秆生产纤维素乙醇竞争力，对碱过氧化氢法预处理后高浓玉米秸秆半同步糖化发酵生产燃料乙醇的工艺进行了研究。建立底物浓度与酶解糖得率关系模型，以确定适宜的底物浓度。向预处理后的玉米秸秆中添加吐温20，考察其酶解过程特性，确定吐温20最适添加量。结果表明，酶解最适条件为：底物质量浓度200 g/L，吐温20添加量8%(ω)。在该条件基础上，对酵母种龄、吐温20对酵母发酵影响、半同步糖化发酵预酶解时间、半同步糖化发酵的时间、发酵温度进行了研究，确定了半同步糖化发酵的工艺条件为：种龄16 h，吐温20添加量5%(ω)，预酶解时间9 h，半同步糖化发酵时间7 d，温度34 ℃。在最佳条件下，发酵7 d后，乙醇浓度达到23.64 g/L，乙醇转化率达到76.54%，较对照组(不添加吐温20)转化率提升3.41%。该工艺条件下能实现高浓玉米秸秆高效转化可发酵糖及乙醇的目的。
关键词 玉米秸秆；碱性过氧化氢预处理； 吐温20； 半同步糖化发酵
对石油日益增长的依赖、化石燃料的日益枯竭以及全球变暖带来的对温室气体减排的需要使得由可再生资源生产燃料变得日益重要。而木质纤维素因为其高含糖量，较高的可用性以及较低的价格成为主要的潜在生物炼制原料[1]。与传统的生物质炼制原料相比，木质纤维素避免了食物与能源之间的竞争，通过生物转化的方式利用木质纤维素生产气体以及液体燃料也被认为是最具前景的生产可再生燃料的方式[2]。而在农业生产过程中产生的废弃物玉米秸秆因其在中国较高的生物质收益量而被认为是合理的生物质乙醇生产原料。目前，降低生物质转化的成本对大规模生产生物质乙醇至关重要。这其中就包括选择合适的预处理、酶解及发酵方式[3]。
碱过氧化氢法预处理能通过破坏木质纤维素结晶区，使孔隙率和内表面积增大，同时去除木质素，因而能有效破除酶解转化可发酵糖的生物质壁障。研究表明，在pH值11.6附近，较高过氧化氢添加量下，碱过氧化氢法在有效去除木质素的同时能最大限度地减小纤维素的损失，因而应用较为广泛[4-5]。对于酶解过程，使用表面活性剂能有效提高几种木质纤维素酶解的转化率[6-8]，非离子型表面活性剂对酶解效率提升效果明显，且吐温20与吐温80表现优于其他非离子型表面活性剂[9-10]。然而传统的对于表面活性剂对生物质转化可发酵糖的研究多集中在相对较低的底物浓度，对于高浓度底物条件下表面活性剂对木质纤维素酶解的影响研究相对较少，而高浓度底物条件下酶解不仅能获得高糖浓度，而且能有效提高单位设备利用率，减少能耗与废水排放量，降低酒精分离过程成本，对于纤维素乙醇的工业生产有重要意义[6-8]。
发酵方式对于纤维素乙醇生产有着同样重要的影响。研究表明，在相同的预处理条件下，与传统的分步发酵方式相比，同步糖化发酵与半同步糖化发酵方式发酵效率明显较高。同步糖化发酵与半同步糖化发酵过程能及时消耗产生的葡萄糖，从而避免了葡萄糖的高浓度积累对酶解反应的反馈抑制[11-14]。
本文在碱性过氧化氢预处理的基础上，结合酶解过程特性、吐温20在高浓玉米秸秆酶解及发酵过程的作用以及高浓玉米秸秆半同步糖化发酵的基本条件的优化，对高浓玉米秸秆半同步糖化发酵工艺进行研究。
1.1.1 原料与酶
玉米秸秆来自山东潍坊(粉碎机粉碎成粉过40目筛,纤维素含量35.83%，半纤维素含量17.69%)，实验所用的纤维素酶(cellic CTecII)以及半纤维素酶(cellic HTecII)来自丹麦诺维信公司，其他化学试剂均购于国内试剂公司，为分析纯试剂。
1.1.2 菌种与培养基
发酵使用菌种为安琪高活性干酵母(湖北安琪酵母股份有限公司)。
培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏5， pH值自然，121 ℃灭菌20 min。
1.2.1 碱性过氧化氢预处理
准确称取 3.0 g 玉米秸秆置于50 mL三角瓶中，称取0.3 g NaOH颗粒，加适量蒸馏水溶解，向混匀的NaOH溶液中加入H2O2溶液，ω(H2O2/玉米秸秆)=10%，将混合均匀的NaOH溶液加入盛有玉米秸秆样品的三角瓶中，混匀后加入H2O2溶液，并补水至实验设计底物浓度。置于30 ℃恒温振荡器中振摇，并调节pH值至11.5～11.7，每隔1 h用5 mol/L NaOH调节1次，使pH值保持在11.5～11.7范围内24 h。
1.2.2 酶解
预处理结束后，向装有预处理玉米秸秆的三角瓶添加72% H2SO4调节pH值至5.2，按照实验设计的酶蛋白添加量(纤维素酶∶半纤维素0.77∶0.23)分别加入一定量的纤维素酶和半纤维素酶(50 mg/g总蛋白/纤维素)，置于50 ℃恒温振荡培养箱中酶解24 h。酶解结束后，沸水浴灭活10 min，于12 000 r/min下离心3～5 min，取上清液1 mL测定单糖浓度。
1.2.3 底物浓度与玉米秸秆酶解糖得率关系
为确定适宜的酶解底物浓度，在上述实验条件下分别考察酶解底物浓度 50、100、150、200、250、300 g/L下酶解效率的变化。
1.2.4 吐温20对高浓玉米秸秆酶解的影响
首先通过单因素实验确定酶解过程吐温20最适添加量。精确称量13.5 g AHP预处理后玉米秸秆于500 mL三角瓶中，200 g/L底物浓度，预处理完毕后分装至25 mL具塞小瓶中，分装为5组，每组3个平行。每组分别添加0%、1%、2%、4%、6%、8%、10%(ω)量的吐温20，按照1.2.2方法进行酶解，24 h后取样测定。
在确定最适吐温20添加量的基础上，监测酶解时间与糖得率的关系，以确定半同步糖化发酵的预酶解结束时间。取15 g玉米秸秆于500 mL三角瓶中，按照1.2.1方法预处理24 h后添加最适添加量的吐温20，参照1.2.2进行酶解，分别于3、5、7、9、11、15、24、36、48 、72 和96 h取样测定糖浓度，平行实验3组，同时设置不添加吐温20组进行酶解取样作为对照组。
1.2.5 吐温20对酵母发酵产乙醇得率的影响
配制300 mL的液态活化培养基(YPD)，121 ℃灭菌后，分装至50 mL三角瓶中，每瓶20 mL，每组3个平行，分别添加0、0.1(2%，5 g/L)、0.25(5%，12.5 g/L)、0.4(8%，20 g/L)、0.5 g(10%,25 g/L)吐温20,接入安琪高活性干酵母，然后放入恒温振荡培养箱 34 ℃，170 r/min 下进行培养，24 h后取样测定乙醇含量。
1.2.6 酵母生长曲线的测定
配制50 mL 的液态活化培养基(YPD)，121 ℃灭菌后，接入安琪高活性干酵母，然后放入恒温振荡培养箱34 ℃，170 r/min下进行培养。分别在培养 2、4、6、8、12、16、24、36和48 h时吸取部分发酵液，稀释一定倍数并在 600 nm 下测定 OD 值。通过Origin 7.5对OD600值和时间进行 Logistic 非线性拟合，即得到生长曲线。经生长曲线确定酵母接种龄为16 h。培养完毕，于超净工作台将菌液倒入50 mL离心管，8 000 r/min、25 ℃离心15 min后去除上清液，接种菌体。
1.2.7 玉米秸秆半同步糖化发酵条件的优化
在预酶解过程条件及半同步糖化发酵酵母种龄、吐温20添加量确定的基础上，对高浓玉米秸秆半同步糖化其他条件：时间与温度进行优化。准确称量15 g玉米秸秆，预处理完毕并121 ℃灭菌后，根据上述实验确定的参数，添加吐温20进行酶解，酶解一段时间后从恒温振荡培养箱中取出，冷却至室温后于超净工作台中接种一定接种龄，离心收集菌体的酵母(种子液酵母接种量0.1 g)。接种完毕置于恒温振荡培养箱中进行发酵，分别考察30、32、34、36、38 ℃以及72 h、7 d发酵条件下糖浓度、乙醇浓度及乙醇转化率。
1.2.8 糖浓度与乙醇浓度的测定
酶解与发酵结束后，取1 mL样液置于1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心3 min，离心完毕取上清液100 μL，蒸馏水稀释10倍后经0.2 μm水系滤芯过滤加入进样管，高效液相色谱测定葡萄糖、木糖浓度与乙醇浓度，并计算转化率。高效液相色谱条件为：HPX-87H色谱柱，流动相为5 mmol/L H2SO4，柱温65 ℃，流速0.6 mL/min，检测器为示差检测器。
1.2.9 计算方法
纤维素-葡萄糖、半纤维素-木糖酶解转化率及纤维素-乙醇理论转化率分别按公式(1)、(2)、(3)计算。
转化率/%
(1)
转化率/%
(2)
转化率/%
(3)
式中： 0.9为纤维素到葡萄糖的转化系数；0.88为半纤维素到木糖的转化系数；0.511为葡萄糖到乙醇的生化计量系数；葡萄糖、木糖、底物、乙醇浓度单位均为g/L，底物质量单位为g，纤维素及半纤维素含量单位为%。
如图1所示，随着底物浓度逐渐增加，葡萄糖以及木糖浓度逐渐提高，而相应的转化率逐渐下降。逐步升高的底物浓度水平带来的是酶解阻碍的增加，液体黏度逐步升高，游离水减少，酶解过程释放的对香豆酸、阿魏酸等酶活抑制物浓度升高，酶解难度也因此逐步增加[12]。在200 g/L底物浓度下，糖得率增长速度达到峰值，葡萄糖浓度为60.35 g/L，木糖浓度为29.08 g/L，相应的纤维素-葡萄糖转化率可以达到80.93%，半纤维素-木糖转化率为77.2%，继续提高底物浓度，糖得率增幅较小。其他的一些研究得出的最适底物浓度也与该研究结果接近[3,15]。该底物浓度下较少的游离水也利于预处理后进行小体系的分装，选择200 g/L作为进一步实验研究的底物浓度。
A-糖浓度变化曲线；B-转化率变化曲线
图1 底物浓度对玉米秸秆酶解糖得率的影响
Fig.1 The effect of biomass loading on sugar yields during
enzymatic hydrolysis of corn stover
图2显示了不同剂量吐温20对玉米秸秆酶解效率的影响，在0～8%添加量范围内，随着吐温20添加量的增加，葡萄糖得率逐渐提高，在8%达到最高，在该添加量下，葡萄糖转化率较不添加吐温20组高8.5%，糖得率得到显著提升。一些研究表明，在料液比较低的情况下，添加吐温20促进酶解的最适添加量为2.5 g/L，但这些研究反应体系的底物浓度普遍低于200 g/L：JESSICA等的反应体系为固液比1∶8(g∶mL)的蔗渣，TORNY等人研究的反应体系为1∶30的云杉，而周丽东的反应体系为1∶15的木薯杆，3者换算成以底物计算吐温20添加量分别为50、75、100 g/L，3者结果相差不大，同时与本实验结果接近，表明吐温20促进木质纤维素酶解的最适添加量与底物量有直接关系，而反应体系固液比对其影响较小[5,7-8]。
图2 吐温20添加量对玉米秸秆酶解转化率的影响
Fig.2 The effect of Tween 20 addition on sugar conversion
during enzymatic hydrolysis of corn stover
对于吐温20提高酶解转化率的原因，TORNY研究表明,吐温20对酶解效率的提高与降低木质纤维素对酶的非特异性吸附有直接的关系，进一步研究表明这种提升是由于木质纤维素表面的木质素与非离子型表面活性剂之间的疏水作用释放了非特异性吸附的酶[7]。进一步增加吐温20添加量，纤维素转化率反而下降，吐温20过量的添加以及相对较低的振荡速率可能会导致体系存在分层现象以及吐温20分子对酶分子的包裹，从而导致酶解效率的相对降低。进一步结合酵母发酵实验确定最适吐温20添加量。
如图3和图4所示，酶解初期，较高的底物浓度下，游离水较少，随着酶解的进行，木质纤维素吸附的自由水被逐渐释放出来，酶解时间3 h，液化明显，相应的糖浓度在3～9 h迅速增加，液化逐渐加快，且添加吐温20组酶解效果优于不添加吐温20组；随着酶解的进行，大量的纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖进一步积累，吐温20组转化率提升幅度明显加快，吐温组与对照组糖浓度与转化率差距逐步加大；在11～15 h逐步进入平台期，较高的糖浓度抑制了酶解反应的高效进行，同时木质素对酶分子的非特异性吸附导致部分酶无法有效发挥作用，逐步升高的酶活抑制物浓度也抑制了酶的活性[16]，糖浓度与转化率增速放缓，在15 h，吐温组与对照组之间糖得率差值达到最大，此时吐温组葡萄糖与木糖转化率为76.75%，65.65%，高于对照组转化率9.08%，3.93%。在15～24 h，糖得率增速进一步放缓；48～72 h转化率变化趋于平缓，进一步延长酶解时间，转化率提升有限。结果表明，吐温20对酶解效率的提升作用在经历逐步提升、逐步下降、保持稳定3个过程，对酶解效率的提高不会因时间的延长而消失。9 h，吐温组葡萄糖与木糖转化率达到24 h酶解效率的87%(分别为70.62%，60.98%)，酶解效果较好，故选择9 h为半同步糖化发酵预酶解周期。
图3 添加吐温20玉米秸秆96 h内糖浓度-时间曲线图
Fig.3 The time curve of sugar concentration in 96 h after
the addition of Tween 20
图4 添加吐温20玉米秸秆96 h内葡萄糖转化率-
时间曲线图
Fig.4 The time curve of glucose conversion in 96 h after
the addition of Tween 20
吐温20对酵母发酵的影响如图5所示，在2%以内，随着添加量的增加，转化率逐步提高。高于2%，转化率逐步下降，但降幅较小，10%添加量较2%添加量转化率下降0.76%，但仍高于对照组2.66%。表明在酵母发酵过程中添加适量吐温20对于酵母活性有提高的作用，但过量添加会影响酵母活性。在酶解实验中初步确定的5%吐温20添加量在酵母发酵中与2%添加量效果相差较小，故5%吐温添加量可行。
图5 吐温20添加量对酵母发酵乙醇转化率的影响
Fig.5 The effect of Tween 20 addition on ethanol yield
in yeast fermentation
温度对玉米秸秆半同步糖化发酵乙醇得率的影响如图6所示，乙醇得率随温度提高逐步提升，在34 ℃达到最大值，此时乙醇浓度为23.4 g/L，乙醇理论转化率为75.78%，继续提高温度，乙醇得率开始下降，38 ℃时下降明显。温度对半同步糖化过程影响较大，不仅影响酵母菌发酵葡萄糖转化乙醇的过程，同时对纤维素酶酶解效率有影响，当温度明显升高，纤维素酶酶活随之提高，进而导致酶解糖得率的提升，但酵母利用葡萄糖能力随逐步升高的温度而明显下降，进而导致乙醇得率的降低[13,16-17]。故34 ℃作为高浓玉米秸秆半同步糖化发酵温度较适宜。
图6 发酵温度对半同步糖化发酵乙醇浓度的影响
Fig.6 The impact of fermentation temperature on
ethanol concentration of SSSF
发酵时间对于乙醇得率有着显著影响，延长发酵时间有助于提升乙醇得率。如图7所示，在34 ℃下，发酵时间为72 h时，对照组与吐温组乙醇含量与乙醇转化率分别达到了10.89 g/L，35.68%；11.87 g/L，38.91%，吐温组在糖得率与乙醇转化率方面均优于对照组，但相对较低的乙醇得率与较高的葡萄糖残留量，表明酵母菌未能对酶解过程释放的葡萄糖进行充分利用，需要对同步糖化时间进行延长。
A-糖浓度；B-乙醇得率
图7 72h/7d半同步糖化发酵糖浓度与乙醇得率图
Fig.7 Sugar concentration and ethanol yields in 72 h/7 d-
SSSF
发酵7 d，对照组同步糖化发酵后乙醇含量达到22.58 g/L，乙醇理论转化率73.13%，与对照组相比，添加5%吐温20后乙醇得率略有提升，乙醇含量与转化率分别提升了1.06 g/L，3.41%。JESSICA等使用Na2SO3与NaOH预处理蔗渣，在质量浓度40 g/L Na2SO3、质量浓度20 g/L NaOH、2.5 g/L(相当于底物质量的2%)吐温20添加量下进行酶解及半同步糖化发酵，乙醇理论转化率为39.5%，较对照组(不添加吐温20)提升14.5%，提升效果显著，但其反应体系底物浓度仅为1∶8(g∶mL)，与高浓度底物体系存在较大差异，高底物浓度下固形物的增加直接导致传质难度的上升，进而影响乙醇的产生，可能是导致本次实验结果提升效果逊于JESSICA研究结果的主要原因[5]。与同步糖化发酵72 h相比，发酵周期为7 d，对照组与吐温组乙醇得率分别提高了11.69 g/L，11.77 g/L，转化率提升了104.96%，96.71%(与发酵72 h相比)。残留葡萄糖含量降低到9.56 g/L，8.83 g/L。继续延长发酵时间意义不大。
碱过氧化氢法预处理玉米秸秆最适底物浓度为200 g/L，在该底物浓度下预处理及酶解能保证转化率与糖浓度均处于较高水平；添加适量吐温20能有效提高高浓玉米秸秆酶解糖得率，这种提升在酶解24 h后趋于稳定，而吐温20添加量与底物量密切相关；吐温20在提高酶解转化率的同时，对于酵母发酵产乙醇效率也有明显提升，并对高浓玉米秸秆半同步糖化发酵乙醇得率有提升效果；温度与时间对于玉米秸秆半同步糖化发酵影响显著，对于利用酿酒酵母进行半同步糖化发酵，最适温度为34 ℃。
本研究以玉米秸秆作为底物，通过考察其酶解过程特性以及吐温20对酵母发酵的影响、酵母的接种龄、半同步糖化发酵预酶解时间，半同步糖化发酵时间、发酵温度，确定了 AHP预处理高浓玉米秸秆的半同步糖化发酵工艺。在该工艺条件下进行半同步糖化发酵，理论乙醇转化率接近80%。
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