【摘要】 目的：观察三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子浓度的作用。 方法：体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞，分别以400 μg/ml和800 μg/ml pns处理细胞，在激光共聚焦显微镜下观察细胞内钙离子浓度的变化。 结果：随着给药浓度的增加，和空白对照组相比，各给药组的细胞内钙离子浓度均有所下降(p<0.05)，两给药组之间差异也具有统计学意义(p<0.05)。 结论：三七总甙能够抑制人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子浓度，并具有剂量依赖效应。
【关键词】 瘢痕;成纤维细胞;三七总甙;钙离子
增生性瘢痕(hypertrophic scar, hs)是临床上常见的皮肤纤维化疾病之一，瘢痕的异常增生和挛缩常常导致患者外观畸形和功能障碍，目前仍未发现满意的预防和治疗方法。药用三七是五加科人参属多年生草本植物三七的根，三七总甙(panax notogin seng， pns)是三七的有效成分，具有防治肝、肾及肺部纤维化疾病的作用[1]，近年来对于三七总甙作用于人增生性瘢痕的研究工作也取得一定的进展[2]。成纤维细胞内的ca2+浓度，与细胞增殖、细胞外基质合成及降解有着密切的关系。本实验通过观察三七总甙作用于体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblast, hsf)后，细胞内ca2 +浓度变化情况，以进一步探讨三七总甙抑制人增生性瘢痕的作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验材料
三七总甙粉剂购置于云南金泰得制药总公司。培养液为 dmem(美国hyclone公司)，医用净化工作台(苏州净化设备公司yj?875型)，二氧化碳培养箱(美国shel?lab1815tc型)，倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂xsj?d型)，olympus光学显微镜，激光扫描共聚焦显微镜(德国)。
1.2 实验方法
1.2.1 人增生性瘢痕成纤维细胞体外培养 实验所用瘢痕组织均为北京军区总医院烧伤整形科的烧伤后瘢痕患者手术所取的标本，均为烧伤创面愈合3个月以上，瘢痕仍持续增生者，共6例。瘢痕的特点：外观发红充血、质硬、高于皮面1 cm以上，瘢痕增生局限于皮损区，局部伴瘙痒或疼痛等不适。瘢痕处于增生活跃期，患者无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病，无心、肺、肝、肾等慢性疾病，6个月内未使用类固醇激素类药物、抗肿瘤药物等，且未曾接受放疗者。采用组织块法进行原代培养。实验所用为3～5代的人增生性瘢痕成纤维细胞。在倒置相差显微镜下观察细胞形态。
1.2.2 三七总甙干预人增生性瘢痕成纤维细胞 实验分3组：空白对照组、400 μg/ml pns给药组、800 μg/ml pns给药组。取第4代人增生性瘢痕成纤维细胞，将细胞按常规方法消化，调整细胞密度为1×105/ml，分别接种于3块含盖玻片的6孔培养板中，进行细胞爬片，8 h后更换培养液，空白对照组加入新配制的10%小牛血清dmem培养基，400 μg/ml pns给药组加入终浓度为400 μg/ml的三七总甙，800 μg/ml pns给药组加入终浓度为800 μg/ml的三七总甙。
1.2.3 钙离子动态变化的测定 fluo?3/am荧光探针用纯二甲基亚砜(dmso)配成1 mmol/l的储备液，低温保存备用。非离子型多元醇表面活性剂pluronic f?127 用dmso 配制成25%溶液(w/v)备用。实验前fluo?3 /am用d ? hanks液稀释至5 μmol/l，并加入配制好的f127 4 μl助溶，加于培养的人增生性瘢痕成纤维细胞样品上，置于5%co2孵箱中孵育1 h。将负载后的小玻片转移到激光共聚焦显微镜的细胞槽内，加入1 ml缓冲液，选择细胞及层面，用激光共聚焦显微镜观察。fluo?3/am激发波长为488 nm，发射波长为525 nm，扫描方式选择时间扫描，激光功率选择30 mw，物镜倍数为20倍，时间间隔为2 s，连续扫描15 min。实验条件在整个观察过程中不变。随机选择3～4个细胞动态扫描细胞内ca2+的荧光吸光度。先扫描记录一段正常波动曲线，再加入药物。fluo?3/am染色的细胞内ca2+浓度变化时，荧光强度会发生改变，ca2+浓度越高，荧光强度越大。利用激光共聚焦显微镜所配备的数据与图像处理软件，计算出整个细胞荧光强度的相对值，以观察ca2+动态变化;细胞内ca2+浓度变化用给药前、后荧光强度变化计算方法：[ca2+] i = (f?f0) /f0 ×100%，其中f表示给药后的荧光强度，由包括峰值在内的3个测定值确定，f0表示静息状态的荧光强度，由平台期3个时间点的测定值确定。
1.3 统计学处理
实验所有计量数据用平均数和标准差(±s)来表示，并采用spss10.0统计软件对数据进行单因素方差分析(anova)，比较组间差异;两两比较用turkey方法，p<0.05为统计学差异显著，p>0.05为无统计学差异。
2 结果
2.1 倒置相差显微镜下观察细胞形态
人增生性瘢痕成纤维细胞在倒置显微镜下观察呈典型长梭形，胞体较大，部分细胞可见向外伸出2～3个长短不一的突起，胞体的两极细长，细胞走向趋于一致，依靠紧密且排列整齐，为典型的成纤维细胞。加入三七总甙处理后，随着药物浓度增大、作用时间延长，活细胞数量逐渐减少，细胞间隔增宽。细胞突起明显缩短，呈多角型，甚或消失。细胞变圆，胞体缩小。细胞质减少，有的呈空泡状，染色质浓缩边聚，胞核模糊或断裂成块状，见图1、2。
2.2 三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子浓度的作用
不同浓度三七总甙处理人增生性瘢痕成纤维细胞后细胞内ca2+荧光强度均呈现增强幅度下降的态势，但持续时间和幅度有所不同，见图3、4。和空白对照组相比较，400 μg/ml组细胞内ca2+荧光强度在5 min之内下降幅度为29%，而800 μg/ml组在5 min内下降幅度为48%，在随后约10 min的观察期内，这种钙荧光水平没有明显下降的趋势，相对稳定于一个平台期，通过数据分析，3组的变化率分别达到0.66%、29.11%、48.26%，见图5。经统计学分析，与空白对照组相比较，两给药组均具有显著性差异(p<0.05)，两给药组之间也具有显著性差异(p<0.05)。以上结果表明，随着pns浓度的增加，ca2+下降时间段在延长，而ca2+荧光强度的峰值也随之而降低。
3 讨论
器官纤维化的基本病理过程包括成纤维细胞过度增殖、异常凋亡以及细胞外基质过量沉积。这一过程改变了组织器官原有的正常结构，引起其功能的相应改变。成纤维细胞是创伤愈合、瘢痕形成以及器官纤维化过程中的功能细胞。其胞质膜上存在ca2+、na+等多种离子通道。正常生理机制钙离子通道对细胞内游离ca2+浓度的调控有一定的限度，在生理状态下，一般胞浆内ca2+浓度约为10-4 mol/l，而细胞外ca2+浓度约为0.1～1 mol/l左右，两者相差3～4个数量级。钙离子通道的状态直接影响到细胞内游离钙离子的浓度，而细胞内游离钙浓度的升降对细胞的增殖起着决定性的作用[3]。细胞内ca2+浓度增高是很多疾病发生的病理生理基础。如果能够找到通过改变ca2+通道活性而影响成纤维细胞增殖及其细胞外基质合成、分泌与降解的药物，对于临床上治疗创伤、瘢痕增生以及器官纤维化具有重大意义。
三七总甙为传统中药材五加科人参属植物三七的有效成分，其块根中含皂甙约为12%。三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖具有抑制作用，400 μg/ml三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞有明显的抑制作用，使得细胞增殖曲线偏离s型形态，800 μg/ml三七总甙给药组中，细胞的增殖曲线为一条明显的下滑线，人增生性瘢痕成纤维细胞的数量明显减少，表明这种抑制作用具有剂量依赖效应[4]。
已有研究表明，三七总甙是ca2+通道阻滞剂[5]，但其对人增生性瘢痕成纤维细胞中ca2+是否存在抑制作用，尚未见报道。本实验用不同浓度的三七总甙作用于人增生性瘢痕成纤维细胞，观察到如下结果：选用荧光探针fluo?3/am 观测细胞荧光强度，以反映三七总甙作用于人增生性瘢痕成纤维细胞中ca2+浓度的变化，发现大约在pns作用1 min后，空白对照组成纤维细胞内ca2+的荧光强度几乎没有改变，而增生性瘢痕成纤维细胞内ca2+的荧光强度逐渐下降，400 μg/ml给药组下降幅度达到了29%，而800 μg/ml给药组荧光强度在5 min之内下降了48%。这表明三七总甙可以抑制增生性瘢痕成纤维细胞内ca2+浓度，并且具有剂量效应。结合前述三七总甙具有抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖的作用[4]，我们推测三七总甙有可能通过降低细胞内ca2+浓度来抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖， 其机制仍需进一步研究。
【参考文献】
1 刘剑毅, 姚恒, 戴霞, 等. 三七总甙抗纤维化作用的研究进展[j].中国美容医学,2006，15(8):985?986.
2 姚恒, 李世荣, 刘剑毅, 等. 三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞转分化的作用[j].中华烧伤杂志,2007,23(3):188?190.
3 fiorio pla a, maric d, brazer sc, et al. canonical transient receptor potential?1 plays a role in basic fibroblast growth factor (bfgf)/fgf receptor?1 induced ca2+ entry and embryonic rat neural stem cell proliferation[j]. the journal of neuroscience, 2005，25(10): 2687?2701.
4 刘剑毅, 李世荣, 纪淑兴, 等. 三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原合成的作用[j]. 第三军医大学学报, 2003，25(17):1562?1563.
5 曾福仁, 尹松梅, 谢双峰, 等. 三七皂甙单体2a?1?1对人血小板聚集和钙内流的作用[j]. 中华血液学杂志，2004， 25(9):544?547.
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