2.5 荧光强度测定［1，2］取负载的血小板悬液37℃温孵5 min，在PE LS-55型荧光分光光度计上做荧光测定，固定发射波长为510 nm，扫激发波长，如激发波长波峰由380 nm移至340 nm，则表明Fura-2/AM已负载酯解进入细胞内。采用FFA模块的改变波长的时间扫描，激发波长分别固定在340 nm、380 nm，波宽5 nm，发射波长固定在510 nm，波宽5nm，记录Fura-2在激发波长340 nm、380 nm处测得的荧光强度比值（F340/F380），然后加入20μl 20％的TritonX-100，测定Rmax，再加入20 μl 0.5 mmol/L的EGTA，测定Rmin，根据比值法公式 计算 出血小板内［Ca2+］i浓度。
［Ca2+］i=Kd×R-(Rmin)(Rmax-R)×SFB
式中Kd为Fura-2/AM与Ca2+反应的解离常数，为224 nmol/L，R为各测定点F340对F380荧光强度的比值。Rmax为加入TritonX-100使得Fura-2和钙离子结合达饱和时所测得的F340/F380，Rmin为加入高于Ca2+浓度2～3倍的EGTA，使得Fura-2游离，测得的F340/F380。SFB为组成Rmin和Rmax的F380之间的比值。实际计算结合FLB中ICBC模块代入公式计算。
2.6 方法各组数据以 表示，用SPSS软件包分别进行配对T检验，以P0.05为有统计学意义。
3 结果
3.1 血小板Fura-2/AM的波峰移动特性固定发射波长为510 nm，在300～400 nm之间扫激发光谱，血小板负载后，激发光波峰在340 n m（如 1，a），去除负载的血小板上清液的激发光波峰在380 nm（如图1），Fura-2的钙结合态和非结合态荧光光谱移动，表明血小板已被Fura-2/AM负载。
3.2 冰片对血小板非特异性Ca2+内流的影响由表1可见，血小板分别用不同浓度冰片血清孵育后，血小板胞内静息［Ca2+］i与相应浓度的空白血清比较无显着差异（P0.05）。在细胞外液加入CaCl2溶液，使其终浓度为1 mmol/L，则各组细胞内游离［Ca2+］i均明显升高（P0.01）。非特异性内流的［Ca2+］i为加入CaCl2后的胞内［Ca2+］i与静息［Ca2+］i之差，可见冰片组与空白血清组非特异性内流的［Ca2+］i之间无显着差略)
3.3 冰片对5-HT诱导的Ca2+内流的作用在细胞外液含有1 mmol/L CaCl2的情况下，加入20 μmol/L的5-HT，血小板内［Ca2+］i缓慢升高，最后达到明显高于基础值的平台期。由表2可见，各组血小板胞内［Ca2+］i均明显高于静息血小板［Ca2+］i（P0.01），说明5-HT能够明显诱导血小板内［Ca2+］i升高。升高的血小板内［Ca2+］i为5-HT引起的胞内质膜释放的钙和5-HT诱导的细胞外液内流的Ca2+，1.2 μg·ml-1冰片血清能够明显抑制5-HT的这一作用，降低5-HT诱导的血小板胞内［Ca2+］i升高（P0.05）。表2 冰片对血小板Ca2+内流的作用(略)
3.4 冰片对5-HT诱导的胞内Ca2+释放的影响在无钙的HEPES缓冲液中加入EDTA，使其在血小板外液中的终浓度为0.1 mmol/L，测得各组血小板胞内静息［Ca2+］i，各组间无显着差异。加入20 μmol/L的5-HT后，血小板胞内［Ca2+］i明显升高，并在高于基础值的位置形成平台期。由表3可见，各组血小板内游离钙离子浓度均明显高于静息值（P0.01），说明5-HT能够明显诱导血小板胞内钙离子释放。加入5-HT测得的血小板内［Ca2+］i与静息［Ca2+］i之差就是由血小板胞内致密颗粒等释放的钙离子，1.2 μg·ml-1冰片血清能够降低血小板释放的［Ca2+］i，与相应浓度的空白血清比较有显着差异（P0.05）。表3 冰片对血小板Ca2+内流的作用(略)
4 讨论
众所周知，Ca2+做为第二信使在血小板活化过程中起到关键性的作用，它是血小板代谢与功能的一个重要调节因子，血小板的变形、聚集、释放反应中都伴有血小板胞浆内游离Ca2+浓度（［Ca2+］i）的升高［3］。5-HT能够浓度依赖地引起血小板胞浆内游离的Ca2+浓度升高［4］，已有研究证实，5-HT诱导的血小板胞内［Ca2+］i升高是一个连续并且相对独立的过程［5］。首先，5-HT刺激血小板胞内储存的Ca2+释放，因此在无细胞外钙存在下5-HT能够引起血小板胞内游离Ca2+浓度的迅速升高，这一作用可以被1 mmll/L EGTA完全阻断。然后，5-HT可以通过激活血小板上的5-HT2受体启动G蛋白耦连信号转导途径，引起血小板胞外Ca2+内流，但是需要很长的滞后时间，这一过程可以补充5-HT诱导的血小板胞内Ca2+储存耗竭。我们的实验也证实了，在细胞外液有无钙离子存在的情况下，5-HT均能引起血小板胞内游离［Ca2+］i升高。
我们的研究结果显示，在1mmol/L细胞外钙存在下，高浓度的冰片血清能够抑制5-HT引起的血小板胞内［Ca2+］i升高，说明冰片能够抑制5-HT引起的外钙内流。同时，在无细胞外钙存在下，高浓度的冰片血清也能抑制5-HT引起的血小板胞内［Ca2+］i升高，说明冰片能够抑制5-HT引起的细胞内钙释放。由此可见，冰片抑制5-HT诱导的血小板内钙释放、外钙内流可能其抑制血小板聚集的作用机制之一。5-HT激活血小板上的5-HT受体，与Gαq蛋白偶联，活化PLC-β，使磷酸肌醇水解生成三磷酸肌醇（IP3）和二酯酰甘油（DAG），从而既可引起血小板胞外Ca2+内流也可诱导血小板胞内贮存的Ca2+释放至胞浆内［6］。冰片对5-HT诱导血小板胞内Ca2+浓度升高的抑制作用，是否与其影响5-HT受体信号转导通路有关，还需进一步证明。
【 参考 文献 】
1］丁敏，钟梁. 用Fura-2/AM测定血小板胞浆游离钙浓度［J］. 大学化学，2004，19(4):48.
［2］尹松梅，陈晓琳，聂大年，等. 氯通道阻断剂对血小板胞浆游离钙和血小板聚集的影响［J］. 中华血液学杂志，2005，26(3):170.
［3］Sanders D， Pelloux J， Brownlee C， et al. Calcium at the crossroads of signaling［J］. Plant Cell, 2002，14 Suppl:S401.
［4］Wockel， L.， Koch, S., Stadler, C., et al.， Serotonin-induced platelet intracellular Ca2+ response in patients with anorexia nervosa［J］. Pharmacopsychiatry， 2008，41(1): 10.
［5］Turetta， L.， Donella-Deana, A., Folda, A., et al. Characterisation of the serotonin efflux induced by cytosolic Ca2+ and Na+ concentration increase in human platelets. Cell Physiol Biochem， 2004，14(4～6):377.
［6］Turetta， L.，Banzzan, E., Bertagno, K., et al.， Role of Ca2+ and protn kinase C in the serotonin (5-HT) transport in human platelets. Cell Calcium， 2002，31(5): 235.
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