文章来源：中华内分泌代谢杂志, 2017,33(03): 185-189
作者：隆敏 郑宏庭
一、氧化应激与NRF2的调控
氧化应激是指在遭受各种有害刺激情况下，机体内活性氧簇产生与抗氧化防御之间严重失衡，继而导致组织损伤的过程。NRF2作为一种在氧化应激及炎症相关组织损伤中氧化还原敏感转录因子，于1996年由Kan克隆得到，是帽和领(cap'n’collar, CNC)转录因子家族成员，含6个高度保守的结构域，分别为Neh 1～Neh 6。NRF2广泛表达于全身各个组织器官，Zhang等首次完整地证实了其负性调控机制—— Kelch样ECH相关蛋白(Kelch liked ECH-associated protein 1, Keap1)介导的泛素化降解，奠基了NRF2通路的调控理论，称之为NRF2信号的经典激活途径。Keap1包括3个主要的结构域：N端BTB域、连接区域、C端Kelch域，1999年由Yamamoto克隆得到。正常情况下，细胞质中的NRF2通过Neh2结构域与Keap1结合成二聚体形式，诱导NRF2泛素化降解，导致胞浆及进入胞核内的NRF2处于低水平状态，进而保持NRF2下游基因处于基础表达水平，细胞处于稳态。当受到外界氧化应激分子或亲核物质刺激时，Keap1中的半胱氨酸残基(C151、C273、C288)构象发生改变，NRF2与Keap1解离，游离的NRF2由胞浆入核，通过与抗氧化反应原件(antioxidant response element, ARE)相互作用，调节其下游数十种抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的表达，中和过多活性氧簇，维持细胞氧化还原平衡，发挥重要的细胞保护功能。具体来讲，NRF2下游基因主要包括三类：(1)抗氧化蛋白：谷胱甘肽过氧化酶、血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)、谷胺酸半胱氨酸连接酶等，具有保持细胞内谷胱甘肽稳态，降低细胞内活性氧簇水平的功能；(2)Ⅱ相解毒酶：谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸：醌氧化还原酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate: quinone oxidoreductase，NQO)1等，主要参与分解有毒物质，促进有毒物质代谢与消除；(3)转运蛋白：多药耐药相关蛋白，参与调控内源性物质与外源性物质输出和摄取。综上，NRF2通过调控其下游基因表达，在抗氧化应激及抗炎中发挥枢纽作用，是迄今为止最为重要的内源性抗氧化应激通路之一。
二、NRF2通路与糖尿病
越来越多的证据显示，在肿瘤、神经退行性疾病、炎症、急性肺损伤、肝肺纤维化以及糖尿病等疾病的发病机制中均存在氧化应激损伤的因素。新近，几个国内外课题组更是将糖尿病及其发病机制聚焦于氧化应激，并揭示了两者的密切关联，开启了糖尿病研究的新方向[7,8,9]。正常状态下活性氧簇生成与消除维持着动态平衡，与之不同的是，糖尿病患者机体活性氧簇生成明显增多，诱发强烈氧化应激反应。实际上，近些年本课题组的一系列研究不断证实了NRF2通路在糖尿病慢性并发症，包括糖尿病肾病、糖尿病溃疡及糖尿病肌萎缩中的保护作用[10,11,12,13]。课题组发现无论是离体研究中采用高糖模拟糖尿病高糖状态干预的靶细胞，或是在体糖尿病动物模型，亦或糖尿病患者组织中活性氧簇水平均明显升高，NRF2通路激活。分析认为NRF2通路激活极有可能是机体的自我防御保护性机制，然而，由于这种代偿性保护作用不足以抵消原发不利因素导致的损伤，最终表现出靶组织或细胞受损。
1．NRF2与胰岛β细胞及胰岛素抵抗：
基础条件下，胰岛β细胞自身抗氧化酶水平极低，高浓度活性氧簇可导致胰岛β细胞功能障碍，抑制胰岛素分泌[14]；激活NRF2能够抑制胞内活性氧簇蓄积，减轻细胞凋亡，减弱对胰岛β细胞的损伤，恢复胰岛素分泌功能；而NRF2缺失则可恶化胰岛β细胞受损程度[15]。进一步研究发现采用NRF2激动剂——莱菔硫烷(sulforaphane, SF)预处理胰腺β-细胞，可显著减弱白细胞介素-1β与干扰素-γ所致细胞损伤；在体实验中，利用SF预处理同样能够减轻链脲佐菌素(STZ)所致的小鼠胰岛破坏，恢复大部分胰岛细胞功能，使胰岛素分泌水平恢复；深入机制研究揭示NRF2激动剂能够通过增加NRF2蛋白水平与上调其下游基因表达，抑制NF-кB信号途径，减少氧化应激所致β细胞损伤[16]。此外，一系列研究已经证实：在糖尿病早期，NRF2通过钝化高葡萄糖触发活性氧簇信号通路，代偿性地使得葡萄糖刺激胰岛素分泌增加，甚至恢复至正常水平；在糖尿病晚期，NRF2则可诱导抗氧化酶表达，保护β细胞免受进一步氧化损害，最大限度地减少其对胰岛细胞分泌功能的影响[17]。
另一方面，NRF2亦参与胰岛素抵抗的调控。研究发现，激活NRF2可明显减少丙酮醛所致Hep G2肝细胞的胰岛素抵抗[18]；NRF2激动剂还可激活AMPK信号通路，抑制p70S6激酶的活化、增加葡萄糖转运蛋白4表达，进而抑制高脂小鼠胰岛素抵抗的产生，增加胰岛素敏感性[19]；此外，NRF2激活还可通过抑制白色脂肪组织内巨噬细胞渗入和增加脂联素生成，减少肝脏炎症和NF-кB活性，抑制脂肪、肝脏、全身炎症，从而减轻肥胖所致胰岛素抵抗作用[20]。
2．NRF2与糖尿病微血管并发症：
糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病是最常见的糖尿病微血管病变，虽然发病机制尚未完全阐明，但研究发现其与氧化应激损伤存在密切联系。与NRF2野生型糖尿病鼠相比，NRF2基因敲除型糖尿病鼠视网膜血管渗透性显著增加、活性氧簇水平较高、谷胱甘肽水平低下、早发血-视网膜屏障功能障碍且视觉功能障碍较重[21]。本课题组关于NRF2通路与糖尿病的研究，最早开始于发现NRF2对糖尿病肾病的保护作用：初步观察发现糖尿病肾病患者肾小球球部的NRF2蛋白表达明显上调，并分析可能与高糖所致的氧化应激损伤相关[10]；动物研究揭示，NRF2基因敲除糖尿病小鼠肾脏组织的氧化应激水平和肾脏受损程度显著高于NRF2野生型糖尿病鼠；进一步离体研究也发现高糖导致人肾脏系膜细胞产生大量的活性氧簇，并激活NRF2及其下游基因的表达，提示高糖所致的球部氧化应激损伤反馈性激活了NRF2通路[10]。采用经典NRF2激动剂SF及肉桂醛(cinnamaldehyde, CA)干预糖尿病肾病，发现在糖尿病小鼠模型体内进一步激活NRF2通路可减弱糖尿病常见的糖代谢紊乱症候群并显著改善肾小球球部病变，而该作用仅限于NRF2野生型鼠，表明其功能通过特异的NRF2通路激活[13]。在此基础上，课题组进一步发现在狼疮肾炎动物模型中，NRF2基因敲除鼠肾脏中的炎性因子NF-κB与转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、纤连蛋白、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)均有更高水平的表达，伴随更为严重的肾脏病理学改变；并且在肾小球系膜细胞中，致肾炎单克隆抗体R4A的效应同样经由NF-κB通路，上调TGF-β1、纤连蛋白的表达与iNOS的水平；通过siRNA抑制NRF2，显著加重了R4A的效应，提示NRF2与炎性通路NF-κB之间存在对话(cross-talk)，NRF2在肾脏通过负性调控NF-κB，下调TGF-β1的表达，从而缓解肾脏病变[22]。本课题组的上述一系列研究预示着NRF2有望成为糖尿病肾病新的干预靶标，被墨尔本贝克心脏与糖尿病研究中心de Haan教授[23]撰写专家述评，认为NRF2通路激动剂将成为极具前景的糖尿病肾病治疗新靶点。
3．NRF2与糖尿病大血管并发症：
NRF2在糖尿病大血管并发症发生发展中同样发挥着重要的保护作用。一项采用低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, Ldlr)敲除动脉粥样硬化模型小鼠的研究发现，与接受NRF2野生型骨髓细胞移植的Ldlr小鼠相比，接受NRF2敲除型骨髓细胞移植的Ldlr小鼠动脉损伤面积更大，巨噬细胞凋亡、迁移更为明显，炎症反应和促炎症基因表达增加，提示NRF2缺失可能恶化糖尿病伴随的动脉粥样硬化进展[24]。一方面，激活高糖干预血管平滑肌细胞内NRF2通路，可减少血管平滑肌细胞增殖及迁移，减轻糖尿病大鼠颈动脉粥样硬化性模型中新生内膜增生[25]。此外，通过NRF2-siRNA或Keap1过表达方式抑制冠脉内皮细胞NRF2通路可导致参与血管生成细胞的增殖和黏附功能受损，细胞迁移及形成毛细血管样结构能力降低，提示NRF2在血管新生过程中发挥重要作用[26]。
4．NRF2与糖尿病溃疡：
进一步研究揭示NRF2参与糖尿病溃疡创口愈合。通过对糖尿病溃疡患者临床样本的收集分析发现，糖尿病患者皮肤溃疡周围组织较非糖尿病外伤患者创口周围皮肤组织遭受更严重的氧化应激损伤，局部细胞凋亡更严重，NRF2介导的抗氧化应激反应也更明显[11]。离体研究发现，高糖环境使得人永生化角质化细胞Hacat内活性氧簇堆积，伴随NRF2与Ⅱ相解毒酶上调，这与既往在糖尿病肾病病变中的初期发现相似[10,11]。进一步研究证实活性氧簇堆积抑制Hacat细胞的增殖/迁移、以及增殖相关蛋白表达，同时诱导凋亡相关蛋白与基质金属蛋白酶表达上调，NRF2-siRNA干扰后，细胞增殖/迁移能力进一步下降，而SF与CA可一定程度逆转上述改变。与Werner S研究小组报道一致，本课题组也观察到NRF2基因敲除小鼠创口愈合与NRF2野生型小鼠并无显著差别[27]。但本课题组还发现使用STZ诱导建立糖尿病模型后，NRF2基因敲除糖尿病小鼠创口愈合明显延迟于NRF2野生型糖尿病小鼠[11]。结合此前相关的一系列研究，提示基础状态下NRF2基因敲除小鼠与NRF2野生型小鼠表型差异并不明显，只有在一定诱发条件下，这种差异才得以突显出来。推测这种现象的本质归因于NRF2作为机体的一种自我保护性抗氧化机制，基础条件下处于非激活低水平状态，只有在应激情况下才显示出其强大代偿和自我调控能力，从而减弱机体氧化应激受损程度，这种有趣的特质也是NRF2不同于其他常见分子最重要的特点之一。随后研究也进一步证实了上述分析：相比于野生型小鼠，NRF2基因敲除糖尿病小鼠不仅创口愈合明显延迟，而且创口处皮肤组织氧化应激损伤更重且凋亡明显；NRF2诱导剂激活NRF2信号通路明显促进NRF2野生型糖尿病小鼠创口愈合；体外研究发现NRF2可通过调节高糖导致的细胞氧化应激损伤、人表皮细胞增殖及迁移能力、细胞凋亡、改善细胞外基质水平等从而促进创口愈合[11]。
5．NRF2与糖尿病肌萎缩：
另外，NRF2还参与糖尿病肌萎缩与骨骼肌细胞分化过程。研究发现相较于STZ诱导的NRF2野生型糖尿病小鼠，NRF2基因敲除糖尿病小鼠快肌纤维大小、Ⅱ型肌纤维肌球蛋白、肌球蛋白异构体与线粒体亚基发生显著改变，进一步的研究发现过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子-1α(peroxisome proliferators activated receptor gamma co-activator 1α，PGC-1α)在NRF2基因敲除糖尿病小鼠比目鱼肌中的表达均显著降低，提示NRF2参与糖尿病肌萎缩与骨骼肌细胞分化可能与PGC-1α相关。体外研究表明，采用NRF2-siRNA可导致小鼠成肌细胞C2C12变异明显加重，PGC-1α降低；而使用NRF2激动剂SF，则可以明显抑制肌细胞C2C12的变异，PGC-1α增加，表明NRF2在骨骼肌细胞分化过程中扮演着重要的角色，并参与调控了糖尿病肌萎缩模型中骨骼肌收缩与代谢特性的分子改变[12]。
三、NRF2激动剂临床应用前景与展望
本领域前期研究结果极大地推进了应用抗氧化剂防治糖尿病慢性并发症的可能性。事实上，全球首个使用治疗糖尿病肾病的NRF2激动剂(bardoxolone methyl)在其Ⅱ期临床试验中显示出良好的临床治疗效果[28]，遗憾的是在Ⅲ期临床试验中，由于干预组严重心血管事件发生明显高于对照组而被迫终止[29]，值得欣慰的是，随后的基础研究证实非高度特异性及剂量依赖性生物学效应可能是导致该种NRF2激动剂出现严重不良反应的重要原因[30,31,32]。总之，这些研究提示NRF2激动剂用于临床糖尿病慢性并发症的治疗还需要进一步深入探索。另一方面，一项基础研究发现目前临床常用抗糖尿病药物，如二肽基肽酶4抑制剂、α-硫辛酸等具有显著的激活NRF2效应[33]，且具有良好的安全性。因此，进一步揭示氧化应激尤其是NRF2通路在糖尿病慢性并发症中的作用，寻找安全有效且靶向性更强的NRF2激动剂用于糖尿病慢性并发症的防治，并阐明其保护机制具有重要意义和广阔的临床应用前景。
一个棘手的问题是：虽然NRF2通路进一步激活有利于改善糖尿病及其并发症预后，甚至有可能应用到临床相关疾病的治疗中。然而，最新一项研究突破性发现了NRF2通路激活明显促进已有肿瘤远处转移[33]。事实上，NRF2在肿瘤中的'双重角色'已被不少研究所证实[4,5]，这无疑将对NRF2激动剂应用于糖尿病临床治疗，尤其是糖尿病合并肿瘤患者治疗提出一个不可规避的难题，同时也警示在进行科学研究并将所得结果应用于临床前必须反复权衡、客观分析，最终才能使得糖尿病患者能够真正地从本研究中得以获益。当然，目前证据显示未合并肿瘤却长期遭受慢性并发症折磨的糖尿病患者极有可能从NRF2激动剂应用中获益。客观来讲，NRF2通路在其他尚未阐释的糖尿病慢性并发症中是否同样具有保护作用，亦或扮演类似于肿瘤中的'双重角色'有待未来深入研究。
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