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在mTeSR™1中生长的人ES和iPS细胞的传代
小编友情提示：今天的视频有中文字幕哦！
上期
hPSC维持培养专题的微信我们介绍了如何使用mTeSR™1培养人ES和iPS细胞。在mTeSR™1培养基中维持培养的人ES和iPS细胞可以用多种方法进行传代，包括有酶和无酶方法。为了达到最佳的性能，选择一种合适的且能兼容所用培养基的传代试剂是非常重要的（如表1）。我们推荐使用无酶法，方便使用，细胞回收率高，维持细胞表面蛋白质的完整性，有助于细胞重新黏附于基质。
表1. 兼容的基质和传代试剂
基质
兼容的传代试剂
Vitronectin XF™
ReLeSR™
温和细胞解离试剂（GCDR）
Corning® Matrigel®
ReLeSR™
温和细胞解离试剂（GCDR）
分散酶
本期我们就来重点介绍无酶法的传代流程：
下面的操作步骤适用于6孔板的单孔操作。如果使用其他培养器皿，请对应地调整体积。
1. 传代前至少提前一个小时，使用Vitronectin XF™或Corning® Matrigel®包被孔板。
2. 分装够用的mTeSR™1，将其恢复到室温（15-25°C）。
注意：不可将mTeSR™1在37°C水浴加热。
3. 在显微镜下识别已发生分化的区域，然后用毡制粗头笔或透镜标志器在培养皿底部标记这些区域。
4. 用移液枪头或吸引器去除标记区域内发生分化的部分。避免培养板在培养箱外放置超过15分钟。
注意：如果分化区域小于5%，可以不需要刮除。如果培养物状态良好，分化区域不应超过20%。分化区域的典型图片可参见我们的中文技术手册。
5. 吸走孔中的培养基，加入1 mL的GCDR。
6. 室温孵育，推荐的孵育时间见表2。
表2. 不同基质使用温和细胞解离试剂的孵育时间
基质
与GCDR的孵育时间*
示意图
Vitronectin XF™
6-12分钟
图1
Corning® Matrigel®
6-8分钟
图2
*孵育时间根据不同的细胞系或者不同的无酶传代试剂可能会有所差异，因此解离过程需要在显微镜下监控，直到确定最佳的孵育时间。
图1. GCDR对在Vitronectin XF™基质和mTeSR™1中培养的人ES细胞的影响。人胚胎干细胞（H9）与GCDR孵育期间在不同时间点的图像。图片用了三种放大倍率：20X，40X和100X。推荐的孵育时间为6-8分钟，此时克隆边缘的细胞之间出现间隙。时间过短，集落没有充分解离；时间过长，集落过度离解，并且在刮擦时可能会分解为单细胞。请注意，使用不同的细胞系或其他非酶传代试剂时，孵育时间可能会有所不同，因此应在显微镜下监测解离过程，直至确定最佳时间。
图2. GCDR对在Corning® Matrigel®基质和mTeSR™1中培养的人iPS细胞的影响。人iPS细胞（STiPSM001）与GCDR孵育期间在不同时间点的图像。图片用了三种放大倍率：20X，40X和100X。推荐的孵育时间为6-8分钟，此时集落边缘的细胞之间出现间隙。时间过短，集落没有充分解离；时间过长，集落过度离解，并且在刮擦时可能会分解为单细胞。请注意，使用不同的细胞系或其他非酶传代试剂时，孵育时间可能会有所不同，因此应在显微镜下监测解离，直至确定最佳时间。
7. 吸走GCDR试剂，加入1 mL的mTeSR™1培养基。用玻璃移液管或细胞刮（例如Corning产品号 #3010或Fisher产品号 #08-100-240）轻轻将集落刮取下来。
注意：尽量不要破坏克隆的完整性。操作时要务必小心，尽量防止集落解体。
8. 将刮取下来的细胞聚集体转移到15 mL锥形管中。
可选步骤：再向孔内添加1 mL的mTeSR™1培养基并进行冲洗，以收集残余的细胞聚集体。
注意：无需对聚集体进行离心分离。
9. 小心吸取细胞混合物并上下吹打2-3次，以打散聚集体。根据基质的不同，打碎聚集体的方式也有所差异，参照表3。均一的50-200 µm的的聚集体悬液是最佳的，不要将其制备成单细胞悬液（更多信息请参见我们的中文技术手册）。
表3. 建议打散细胞聚集体的方法
基质
吸管类型
吹打次数*
Vitronectin XF™
1 mL 枪头
1-2
Corning® Matrigel®
2 mL 血清学移液管
2-5
* 吹打的次数可以根据期望的聚集体大小进行调整。合适的聚集体大小参考图3，并且可以调整步骤以获得期望的结果。
图3. 铺板时适宜的细胞聚集体的大小。细胞聚集体大小可以通过上下吹打的次数来获得。避免生成单细胞。使用两个放大倍率拍摄的图像：40X和100X。
10. 将聚集体按照所期望的密度铺板到包被好的并含有mTeSR™1的培养孔。当集落密度为最佳状态时，可以对培养物以1:10至1:50的分配比例（即将1个培养孔内的细胞聚集体分别铺板到10-50个新的培养孔中），每4-7天进行一次传代。如果集落太密集或者太稀疏分散，可在下一次传代的时候调整传代分配比例（更多信息请参见我们的中文技术手册）。
注意：将细胞聚集体迅速转移到新的培养皿中，以最大限度地提高其存活率及贴壁率。
11. 将孔板放入37°C培养箱。将孔板前后左右快速摇晃几次，确保聚集体分布均匀。24小时内不可扰乱培养板。
注意：细胞聚集体的不均匀分布也许会导致人ES和iPS的分化增加。
12. 每天换液，目测评估监控生长状态，直到下一次传代。
更多关于hPSC培养、传代、冻存等的标准操作流程，请参见技术手册：在mTeSR™1中维持培养人多能干细胞。您也可以点击这里申请纸质版操作手册。想了解更多关于多能干细胞的知识？您也可以点击这里申请我们与Nature Reviews Molecular Cell Biology合作的精美挂图 - Pluripotent Stem Cell Biology。
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