【新生儿疾病】严重高胆红素血症新生儿肠道菌群构成情况及对胆红素脑损伤的影响

作       者：李雁彬　周伟　袁伟明　唐娟　陈晓文　陶莉　魏谋　苏衡　赵宁　黄晓虹　张喆
通信作者：周伟，Email：[e-mail]
作者单位： 510120 广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心新生儿科
本文刊发于 中华实用儿科临床杂志，2018，33(2):103-107.

摘要和关键词

摘要目的　探讨严重高胆红素血症（血清总胆红素水平>342 μmol/L）新生儿肠道菌群的构成情况及其与胆红素脑损伤之间的关系。方法　采取前瞻性研究，选择2016年9月至2017年3月广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心入院时血清总胆红素值>342 μmol/L的新生儿54例作为研究对象，采用16S rDNA序列分析技术检测所有研究对象入院时肠道菌群构成，根据头颅磁共振成像（MRI）、脑干听觉诱发电位（BAEP）及临床表现，将研究对象分为脑损伤组（26例）和无脑损伤组（28例），比较2组新生儿肠道菌群构成的差异，同时比较2组血清和脑脊液中未结合胆红素水平。结果　脑损伤组血清未结合胆红素水平为（463.51±110.62） μmol/L，无脑损伤组血清未结合胆红素水平为（364.18±63.13） μmol/L，2组血清未结合胆红素水平比较差异有统计学意义（t=4.090，P=0.000 1）。脑损伤组脑脊液未结合胆红素水平为（9.53±2.68） μmol/L，无脑损伤组脑脊液未结合胆红素水平为（6.94±2.31） μmol/L，2组脑脊液未结合胆红素比较差异有统计学意义（t=3.812，P=0.000 3）。2组新生儿脑脊液中未结合胆红素水平与血清中未结合胆红素水平无相关性（r=0.137、0.081，均P>0.05）。脑损伤组肠道菌群在属水平上丰度低于无脑损伤组，其中以Fusobacterium、Catabacter、Succinivibrio、Clostridium、Bacteroides这5类菌属差异有统计学意义（均P<>

关键词胆红素脑损伤；肠道菌群；血脑脊液屏障；脑脊液

        胆红素脑病和胆红素脑损伤是因血清胆红素透过血脑脊液屏障并沉积在基底核、海马等部位而引起的急性中毒性脑损伤，是临床上导致新生儿残疾的重要原因之一，严重者50%~75%死于胆红素脑病急性期，存活的患儿中有75%~90%遗留有不同程度的神经系统后遗症，包括精细运动障碍、运动发育延迟、认知障碍及听觉障碍（听神经病变、失听或者耳聋），严重者出现重度椎体外系运动障碍及显著的听觉、眼运动、认知功能异常^［1-2］，对社会和家庭造成极大的负担。研究表明，胆红素脑病和胆红素脑损伤的发生与进入中枢神经系统的胆红素水平有直接关系。尤其是出生1周内的早期新生儿，其血脑脊液屏障通透性较高，中枢神经系统对毒性物质十分敏感，所以在血清未结合胆红素水平较高的情况下极易产生胆红素脑病和胆红素脑损伤^［3］。但是，出生后早期血脑脊液屏障的通透性及影响因素尚不十分明确。有研究表明肠道菌群对神经系统的发育和功能有重要影响，包括突触形成、递质释放、营养物质的产生、血脑脊液屏障的发育等^［4］。为此，本研究拟通过前瞻性研究方法，采用16S rDNA序列分析技术检测严重高胆红素血症新生儿肠道菌群构成情况，比较发生胆红素脑损伤和未发生胆红素脑损伤新生儿肠道菌群构成的差异，旨在阐明肠道菌群与胆红素脑损伤发生的关系，为减少和预防胆红素脑损伤的发生提供新的思路。

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资料与方法

1.1　一般资料　将2016年9月至2017年3月广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心新生儿科收治的符合以下标准的严重高胆红素血症新生儿54例纳为研究对象：（1）出生体质量>2 500 g，胎龄37~42周，血清总胆红素水平>342 μmol/L，且入院前未行光疗，未使用益生菌、抗生素治疗，未输注丙种球蛋白和清蛋白；（2）排除伴缺氧缺血性脑病、脓毒症、颅内出血、细菌性脑膜炎、癫痫、遗传代谢病、反复低血糖及其他诱发神经系统异常的疾病，排除先天性神经系统发育异常疾病；（3）排除胃肠道发育畸形、肠炎、肠功能紊乱及其他诱发消化系统异常的疾病；（4）纳入对象母亲年龄25~35岁，无明显偏食挑食史，无产科并发症，分娩前1个月未使用抗生素及微生态制剂，无腹泻、痢疾等胃肠道疾病史，妊娠期无重大疾病史。研究对象的监护人均签署知情同意书，该研究经医院医学伦理委员会审查批准（第20161118101号）。
1.2　分组　根据《实用新生儿学》中的诊断标准^［5］及脑干听觉诱发电位（BAEP）检查结果^［6］，将研究对象分为脑损伤组（26例）和无脑损伤组（28例），2组一般情况比较差异无统计学意义（表1）。

1.3　主要实验仪器　包括DXC800全自动生化分析仪、3.0T磁共振仪（德国西门子）、诱发电位仪（美国尼高力公司）、胆红素测定试剂盒（美国Beckman-Coulter 公司）、粪便基因组提取试剂盒（中国江苏康为世纪公司）、DNA聚合酶（美国TaKaRa 公司）、Qubit（美国Life Tech公司）、Illumina Miseq 测序仪（美国Illumina公司），大型台式离心机（美国Thermo公司）、低温冰箱（-20 ℃，中国海尔公司）等。
1.4　方法
1.4.1　胆红素水平测定　入院3 h内，在给予相应治疗前抽取静脉血2 mL，采用DXC800全自动生化分析仪检测血清胆红素水平，同时行腰椎穿刺术，抽取脑脊液 2 mL，同样使用DXC800全自动生化分析仪测定脑脊液胆红素水平。试剂盒购于美国Beckman-Coulter公司，具体操作严格按试剂盒说明书进行。
1.4.2　大便采集　入院后立即留取新鲜粪便样本，用无菌粪便采集器采集，所有样本由同一医师收集，立即置-20 ℃冰箱保存备用。
1.4.3　磁共振成像（MRI）检查　入院5~7 d，所有研究对象均行头颅MRI检查。使用20通道头线圈、3.0T磁共振仪（德国西门子）、轴位及矢状面自旋回波序列。扫描参数：层厚4 mm，间距0.8 mm，矩阵224×320，视野180 mm×180 mm；T1加权成像（T1WI）：回波时间 9.7 ms，重复时间4 000 ms；T2加权成像（T2WI）：回波时间108 ms，重复时间4 000 ms；弥散加权成像（DWI）：回波时间100 ms，DWI扫描参数b 800 s/mm²。根据第4版《实用新生儿学》急性期胆红素脑病头颅MRI表现为T1WI和T2WI苍白球中后部的高强度信号这一特征性改变^［5］，由2名放射科医师在未知临床资料的前提下共同阅片、诊断。
1.4.4　BAEP检查　入院5~7 d使用美国尼高力公司Nicolet Bravo诱发电位仪对所有研究对象行BAEP检查。分别将接地电极、记录电极和参考电极固定于前额、头颅正中和耳垂，以强度为90 dB听力级（nHL）短声刺激受试耳，波宽0.1 ms，重复率11.4次/s，滤波范围150~300 Hz，叠加2 000次，解析时间15~20 ms，对侧耳给予35 db nHL白噪声掩蔽，每耳至少测试2次。BAEP异常标准：单侧或双侧 Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波完全或部分消失，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ波潜伏期（PL）>正常值+2.5 s，Ⅰ~Ⅲ或Ⅲ~Ⅴ波间期>正常值+2.5 s，Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波分化异常，同侧Ⅲ~Ⅴ>Ⅰ~Ⅲ波间期，Ⅴ波反应阈>70 spldb。
1.4.5　细菌16S rDNA测序实验及分析流程　留取的大便样品冰上溶化后，利用酶法（Stool Genomic DNA Kit）提取细菌DNA，针对细菌16S rDNA的V3-V4区域进行扩增。使用引物为：上游5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。将扩增后的PCR产物混样并电泳纯化目的片段。使用Illumina建库试剂盒对混合样本进行建库，建库完成后使用Illumina Miseq测序平台，利用双末端测序法对16S rDNA 的PCR产物进行测序。对测序得到的原始数据（Raw Data）进行拼接、过滤，得到有效数据（Clean Data）。然后基于有效数据进行OTUs（Operational Taxonomic Units，可操作分类单元）聚类和物种分类分析，并将OTU和物种注释结合，从而得到每个样品的OTUs和分类谱系的基本分析结果。再对OTUs进行丰度、多样性指数等分析，同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。最后在以上分析的基础上探讨样品之间的物种组成差异。
1.5　统计学处理　应用SPSS 19.0软件，正态分布的计量资料以x̄±s表示，组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布计量资料以M（P₂₅，P₇₅）表示，采用非参数U检验；率的比较采用χ²检验，2组间相关性分析采用Pearson相关性分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

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结果

2.1　无脑损伤组和脑损伤组血清及脑脊液未结合胆红素水平比较　脑损伤组血清及脑脊液未结合胆红素水平均高于无脑损伤组，差异均有统计学意义（均P<0.05），见表2。pearson相关性分析结果显示，纳入研究的54例研究对象血清与脑脊液胆红素水平无相关性（r=0.071，p>0.05），进一步分析示脑损伤组与无脑损伤组血清与脑脊液胆红素水平亦无相关性（r=0.137、0.081，均P>0.05）。

2.2　微生物群落总DNA分离、提取和验证　本研究利用Stool Genomic DNA Kit 提取大便标本中微生物群落总DNA；后续对细菌16S rDNA V3-V4区行PCR扩增，所有样本PCR产物条带清晰，扩增结果符合Illumina MiSeq/HiSeq 高通量测序平台的上机测序要求。Miseq下机数据为具有质量得分的fq格式，质量检测通过fastqc进行（Andrews，2010），脑损伤组和无脑损伤组肠道菌群基因组DNA Miseq测序数据质量检测见图1，测序质量均达标。

2.3　测序数据预处理及OTUs构建　对Illumina MiSeq/HiSeq测序平台得到的数据进行拼接、过滤，得到有效数据。脑损伤组和无脑损伤组样本经过滤后共获得拼接序列平均为40 138条，各样本可用于构建OTUs并且获得分类信息的Tags数目平均为30 012条，脑损伤组和无脑损伤组样本α-多样性参数比较见表3。下机数据进行质控过滤后得到的拼接序列总数（Total Tags）平均数目2组间差异无统计学意义（P=0.308）。可用于构建OTUs并获得分类信息的平均Tags数目（Taxon Tags）2组之间差异无统计学意义（P=0.203）。2组OTUs在科水平的平均数目差异无统计学意义（P=0.110），而脑损伤组OTUs在属水平的平均数目低于无脑损伤组，差异有统计学意义（P=0.025）。脑损伤组Chao1指数、Shannon 指数在科水平的平均数目与无脑损伤组平均数目差异均无统计学意义（P=0.112、0.681），而在属水平的平均数目均低于无脑损伤组，差异有统计学意义（P=0.004、0.038）。

2.4　差异OTU的分析　利用matastats对2组样本进行显著性差异分析，以P<0.05为阈值筛选出了2组样品之间在属水平差异otus（t检验，>

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讨论

        高胆红素血症是新生儿最常见的疾病之一，虽然大部分患儿经治疗可获得好转或治愈，但由于部分地区及人群对新生儿高胆红素血症缺乏足够的认识，胆红素脑损伤的发生率仍然较高。在北美及欧洲等发达国家，胆红素脑病发生率为1∶100 000~1∶50 000^［7］，而在中国其发生率更高，占所有住院新生儿的0.9%，是造成新生儿残疾的重要原因之一。但目前胆红素脑损伤发生的病因和机制仍不完全明确。对于出生1周的新生儿，当血清胆红素>342 μmol/L时即有发生胆红素脑损伤的风险。然而临床却发现，仅部分严重高胆红素血症患儿出现胆红素脑损伤；甚至部分血清胆红素>427 μmol/L的高胆红素血症患儿并不发生胆红素脑损伤（无胆红素脑病临床表现及影像学改变），而部分血清胆红素<342 μmol/l却发生了胆红素脑损伤。本研究的研究对象血清总胆红素水平均="">342 μmol/L，脑损伤组脑脊液胆红素水平明显高于无脑损伤组，说明脑脊液胆红素水平决定了是否发生胆红素脑损伤。虽然本研究结果显示脑损伤组血清和脑脊液胆红素水平均高于无脑损伤组，但脑脊液胆红素水平并不一定与血清胆红素水平呈正相关，提示血清未结合胆红素水平并不是以相对固定比例透过血脑脊液屏障，有理由认为除了血清未结合胆红素水平之外，血脑脊液屏障通透性也是影响胆红素脑损伤发生的重要因素。
        然而，出生后早期影响新生儿血脑脊液屏障通透性的因素是什么，目前尚未见相关报道。研究表明，肠道菌群对于血脑脊液屏障的发育和功能起重要的意义。Braniste等^［8］研究表明，在缺乏正常肠道菌群的小鼠，其内皮细胞紧密连接蛋白表达下降，导致血脑脊液屏障的通透性增加；将正常小鼠的肠道细菌移植至无菌小鼠后，则可以逆转这种效应。他们的研究证实肠道菌群能够影响血脑脊液屏障的发育和功能，而血脑脊液屏障的通透性与胆红素脑损伤的发生密切相关。据此，推测肠道菌群可能通过影响血脑脊液屏障结构和功能，从而影响胆红素透过血脑脊液屏障引起胆红素脑病或胆红素脑损伤。理论上说，宫内的胎儿处于“无菌”的环境，其肠道也是没有细菌定植的，分娩方式、喂养方式、是否应用抗生素等均会使新生儿早期的肠道菌群的构成出现差异，这些差异是否与胆红素脑损伤的发生有关？为了证实以上推测，本研究采用16s rDNA序列分析技术检测了严重高胆红素血症患儿的肠道菌群构成，并对脑损伤组和无脑损伤组肠道菌群进行比较分析。结果新生儿肠道中鉴定出10多个菌门的100多种细菌种系，通过稀释曲线、Chao1指数、Shannon指数对各组样本进行复杂度分析，证实测序量足以覆盖肠道内细菌种属，各组样品丰富度和均匀度均较好。在门水平主要以Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria为主，占 99%以上；纲水平主要以 Bacilli、Clostridia、Gammaproteobacteria、Bacteroidia为主；在科水平以Enterobacteriaceae、Bifidobacteriaceae为主；属水平以Bifidobacterium、Escherichia-Shigella、Enterobacter为主。这些结果与最近关于出生后早期肠道菌群构成的研究结果一致^［9-11］。通过α-多样性分析，2组肠道菌群在科水平上丰度无明显差异；在属水平，脑损伤组菌群的丰度低于无脑损伤组，说明2组患儿肠道菌群的多样性是存在差异的。利用matastats对2组菌群在属水平上差异性做进一步分析，脑损伤组Fusobacterium、Catabacter、Succinivibrio、Clostridium、Bacteroides丰度明显低于无脑损伤组。根据微生物学分类，Catabacter、Clostridium这2类菌属来自梭菌目，Fusobacterium来自于梭杆菌目，Succinivibrio来自于琥珀酸弧菌属，Bacteroides拟杆菌属。而梭菌、梭杆菌、拟杆菌及琥珀酸弧菌在结肠内通过代谢碳水化合物能产生乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等一系列短链脂肪酸，这些是肠道内短链脂肪酸的重要来源^［12］。短链脂肪酸具有促进肠道蠕动^［13-14］，参与调解食欲^［15-16］，及通过促进紧密连接蛋白的表达从而达到增强肠上皮细胞屏障功能的作用^［17］。同时，短链脂肪酸还能够通过循环系统运输至各个器官，包括神经系统以增强上皮细胞屏障功能，从而促进血脑脊液屏障的发育及改善其屏障功能^［8，18］。Braniste等^［8］通过在无菌成年小鼠体内单一定植梭菌（主要产生丁酸盐）或拟杆菌（主要产生乙酸和丙酸），小鼠血脑脊液屏障的通透性均会降低，不仅如此，口服丁酸盐或其他短链脂肪酸（如乙酸和丙酸）也能出现这种效应。但其具体机制尚不明确，这可能与其能够上调闭合蛋白在额叶皮质和海马的表达及改变脑微血管内皮细胞的组蛋白乙酰化有关^［8］。结合Braniste等^［8］的研究结果及本研究结果推测，肠道菌群通过影响血脑脊液屏障的结构与功能从而与胆红素脑损伤的发生相关。
        综上所述，发生胆红素脑损伤的患儿肠道菌群的多样性低于未出现胆红素脑损伤患儿，尤其是梭菌、梭杆菌、拟杆菌及琥珀酸弧菌等能够产生短链脂肪酸的菌群丰度在2组之间差异有统计学意义，而短链脂肪酸与血脑脊液屏障的发育密切相关，说明肠道菌群能够通过调节血脑脊液屏障的通透性从而影响胆红素脑损伤的发生。但16S rDNA序列分析技术本身存在一定的局限性，其仅能在科、属水平对菌群进行分类，所以具体是哪一种还是几种细菌对血脑脊液屏障的发育具有重要作用，以及其促进血脑脊液屏障发育的机制尚不明确，还有待进一步的研究加以证实。

参考文献略

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