作者:李千 王丽华 王健健 张荟雪 单雪 孔晓彤
目的
探讨microRNA-27a-3p在重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者胸腺组织中的表达水平并分析其临床意义。
方法
收集2004年12月至2015年2月于哈尔滨医科大学附属第二医院胸外科经手术治疗的19例MG患者的胸腺组织标本作为病例组,17例经手术治疗的非MG患者胸腺组织及心外科先天性心脏病患者手术时切取的胸腺组织标本作为对照组,通过实时荧光定量PCR方法检测,采用Wilcoxon秩和检验分析两组标本中microRNA-27a-3p的表达情况。采用Spearman秩相关分析方法分析MG组胸腺中microRNA-27a-3p的表达水平与定量重症肌无力评分(Quantitative Myasthenia Gravis Score,QMGS)之间的相关性。
结果
(1)MG患者胸腺中microRNA-27a-3p的表达水平[0.195(0.049,0.714)]显著高于对照组[0.045(0.004,0.088);Z=-2.646,P=0.008];(2)19例MG患者中,眼肌型MG(ocular myasthenia gravis,OMG)7例,全身型MG(generalized myasthenia gravis,GMG)12例,与OMG[0.035(0.008, 0.103)]相比,GMG患者胸腺中microRNA-27a-3p的表达[0.493(0.157, 1.123)]显著上调(Z=-2.620,P=0.009);(3)microRNA-27a-3p的表达水平与QMGS之间具有正相关性(r=0.576,P=0.010)。
结论
microRNA-27a-3p在MG患者胸腺中异常高表达,可能与肌无力的严重程度呈正相关,并与其临床类型有关,但与发病年龄、性别、胸腺病理无明显关联。
资料和方法
一、研究对象
收集2004年12月至2015年2月于哈尔滨医科大学附属第二医院胸外科行胸腺切除术的MG患者19例,其中眼肌型MG(ocular myasthenia gravis,OMG)7例,全身型MG(generalized myasthenia gravis,GMG)12例。对照组为同期在本院行胸腺切除术的非MG患者及心外科手术时切取胸腺组织的先天性心脏病患者17例,对照组患者的年龄与性别与MG组均相匹配。
所有入组的MG患者均符合MG的诊断标准[6]:必备条件:(1)典型的症状波动性、病态疲劳性、晨轻暮重;(2)辅助检查:疲劳试验阳性、新斯的明试验阳性;(3)胆碱酯酶抑制剂治疗有效。支持条件:(1)血清学:血清AChR抗体阳性;(2)电生理检查:重复神经电刺激低频刺激时波幅递减10%以上,单神经肌电图示肌纤维电位对时间间隔延长超过55 μs;(3)影像学检查:胸腺CT示胸腺异常(胸腺瘤或胸腺增生)。所有入组患者均未经过免疫抑制剂治疗,并排除其他自身免疫性疾病。
本研究得到哈尔滨医科大学附属第二医院医学伦理委员会批准(批文号:2013-研-074),所有患者均知情同意。
二、主要仪器和试剂
主要仪器包括UV-240紫外可见分光光度计(日本岛津公司),实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。主要试剂包括miRcute miRNA提取分离试剂盒(天根公司,中国北京),miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(天根公司,中国北京),miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(天根公司,中国北京),引物microRNA-27a-3p及内参U6由中国北京天根公司合成。
三、研究方法
1.RNA的提取:
取出胸腺组织30~50 mg放于预冷的研钵中,倒入液氮后迅速研碎,按照miRcute miRNA提取分离试剂盒中的提取步骤提取总RNA,使用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度,选取吸光度(A260/280)比值在1.9~2.1之间的RNA溶液作为后续试验样本,-80 ℃冰箱内保存。
2.逆转录合成cDNA:
按照miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒中的操作要求,将RNA加入2 μl配置20 μl反应体系,简单离心后放入实时荧光定量PCR仪,反应条件为37 ℃ 60 min→85 ℃ 5 min→4 ℃ 15 min,反应产物置于-20 ℃冰箱内保存。
3.实时荧光定量PCR检测:
microRNA-27a-3p及U6严格按照miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒反应体系配置说明来配置反应液,每个样本均为3个复孔,反应条件为94 ℃ 2 min→(94 ℃ 20 s → 60 ℃ 34 s)×40个循环,荧光定量PCR的结果以每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数Ct表示,胸腺组织中microRNA-27a-3p的相对表达量用RQ=2-ΔCt表示,ΔCt=CtmicroRNA-27a-3p-CtU6。
4.评价MG患者的肌无力程度:
采用美国重症肌无力协会(Myasthenia Gravis Foundation of America)制定的定量重症肌无力评分(Quantitative Myasthenia Gravis Score,QMGS)[7]来评价MG患者受累肌群的肌无力严重程度,各肌群的累积计分作为患者的QMGS分值。
四、统计学方法
所有数据采用SPSS 21.0统计学软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(
±s)表示,如方差齐性,则组间比较采用两独立样本的t检验,如方差不齐,则采用两独立样本的t'检验。不符合正态分布的计量资料以M(Q25, Q75)表示,采用Wilcoxon秩和检验进行比较。microRNA-27a-3p的相对表达量与QMGS的相关性采用Spearman秩相关分析方法进行统计学分析。P<>
结果
一、MG组与对照组人口统计学的比较
本研究共纳入19例MG患者,其中男性9例,女性10例,年龄15~73岁,平均(48.37±15.44)岁。对照组患者共17例,其中男性6例,女性11例,年龄1~70岁,平均(42.35±22.04)岁,两组研究对象在性别(χ2=0.175,P=0.676)、年龄(t=0.957,P=0.346)之间的差异无统计学意义。
二、MG组胸腺与非MG组胸腺中microRNA-27a-3p的相对表达
MG组microRNA-27a-3p的相对表达水平为0.195(0.049,0.714),对照组microRNA-27a-3p的相对表达水平为0.045(0.004,0.088)。采用Wilcoxon秩和检验分析显示,microRNA-27a-3p在MG患者胸腺中的相对表达水平较对照组显著升高,差异具有统计学意义(Z=-2.646,P=0.008),详见图1。
图1 microRNA-27a-3p在重症肌无力组和对照组患者胸腺中的相对表达量比较(Z=-2.646,P=0.008)
三、MG亚组患者胸腺中microRNA-27a-3p的表达水平
根据MG的不同特征将其分成以下亚组:男性组9例和女性组10例;早发组(发病年龄<>表1。
在早发组10例MG患者中,7例GMG患者和3例OMG患者胸腺内microRNA-27a-3p的表达水平分别为0.325(0.220,1.123)、0.035(0.023,0.074;Z=-2.165,P=0.030),差异具有统计学意义;在晚发组9例MG患者中,5例GMG患者和4例OMG患者胸腺内microRNA-27a-3p的表达水平分别为0.660 (0.195,0.768)、0.052(0.009,0.288;Z=-1.715,P=0.086),差异无统计学意义。
四、microRNA-27a-3p与QMGS的相关性分析
MG组患者QMGS为4~16分,平均(7.32±2.89)分。采用Spearman秩相关分析MG组胸腺中microRNA-27a-3p表达水平与QMGS之间的相关性,结果提示两者呈正相关性(r=0.576,P= 0.010) ,详见图2。
图2 重症肌无力患者(n=19)胸腺中microRNA-27a-3p的相对表达水平与定量重症肌无力评分之间的相关性结果
讨论
microRNA是一类长度为21~ 25个核苷酸的非编码调控小分子单链RNA家族,它们通过与靶mRNA的3'非翻译区特异性结合,促进靶mRNA的降解或抑制翻译,在转录后水平调控基因的表达从而使细胞表型发生改变,影响细胞的增殖、分化和凋亡等过程[8]。MG的发病机制与分子遗传学关系密切[9,10],越来越多的证据表明microRNA在MG的发病机制中发挥着重要的作用。陈晓莉等[11]采用qPCR的方法发现MG患者外周血单个核细胞的miR-155的表达明显高于对照组,经地塞米松治疗后可使其表达降低。同时抗AChR-IgG1在经地塞米松治疗后表达浓度较低,表明免疫球蛋白的产生及类别转换依赖miR-155。Jiang等[12]发现let-7家族MG患者外周血单核细胞较健康对照组减少。IL-10作为let-7c的靶基因,其表达水平与低下的let-7c呈负相关,揭示let-7c在MG患者中可能通过调节IL-10的分泌发挥免疫调节的作用。Cheng等[13]首次发现MG患者中miRNA-320a的表达显著下调,且通过直接作用于MAPK1、COX-2基因,诱导炎性因子IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-17的产生,从而促进炎性反应。Lu等[14]的研究显示microRNA146在MG患者中表达显著上调,通过参与调控AchR特异性B细胞的活化,介导MG发病。综上,多种microRNA参与了MG的发病过程,且microRNA可以通过多种途径,如调节B细胞的抗体类别转化、调节炎性因子的分泌、调控免疫细胞的活化等在MG的发生与发展中发挥作用,同时在分子水平为我们提供了MG发病机制的一个新的视点,为MG的治疗提供新的可行性靶点。
microRNA-27a是miR-23a~ 24-2~ 27a簇的1个家庭成员,microRNA-27a-3p的编码基因位于19号染色体断臂1区3带1亚带3次亚带(19p13.13),研究表明miR-27a-3p的靶基因包括IL-6的一个前身链、Toll样受体8前体、干扰素调节因子等,这些都是与炎性反应和免疫应答相关的分子。胸腺是一种中枢免疫器官,是产主AchR抗体的最主要部位,胸腺异常可能是MG发病及病情持续的重要环节。关于microRNA-27-3p在MG患者胸腺中miRNA水平的相关研究较少,我们首次发现microRNA-27-3p在MG患者胸腺组织中显著升高,提示microRNA-27-3p可能参与了MG的发病过程。有学者在MG患者胸腺组织中发现了EB病毒感染的证据[15],同时有进一步研究表明EB病毒感染与MG相关[16],EB病毒在MG胸腺中起着致病性的作用,可能导致MG发病或延续MG的自体免疫反应[17]。有趣的是,Cameron等[18]发现淋巴细胞被EB病毒感染后,可以改变细胞内microRNA的表达,可以使microRNA-27a表达上调,由此我们有理由推断,MG患者胸腺组织中microRNA-27a的上调可能与EB病毒感染有关。此外,microRNA-27a还参与负性免疫调节过程,巨噬细胞作为重要的抗原提呈细胞,与免疫应答过程以及MG的发生、发展关系密切,上调microRNA-27a后,TLR2/4激活的巨噬细胞中促炎性细胞因子的表达增强,同时microRNA-27a可负性调节重要的抗炎介质IL-10表达,参与炎症的过度反应,导致免疫相关疾病[19],提示MG患者胸腺中microRNA-27a的上调可能是通过增加胸腺内活化的巨噬细胞中的促炎因子,负性调节抗炎介质IL-10从而导致MG发病。但是microRNA-27a-3p在MG患者胸腺中的确切作用机制仍有待于进一步研究。
本研究结果显示microRNA-27a-3p的表达水平在不同年龄、性别、胸腺病理间差异并无统计学意义,但与MG的临床类型相关,并与QMGS之间具有正相关性,提示microRNA-27a-3p的表达水平可能反映MG患者病情的严重程度。此外,我们发现microRNA-27a-3p在早发GMG患者中的表达显著高于早发OMG患者,这提示microRNA-27a-3p可能在早发GMG的发病机制中发挥着重要的作用。
Punga等[20]对比了在AchR阳性MG患者外周血中表达异常的13个microRNA,发现差异比较显著的有miR-150-5p、miR-27a-3p、miR-21-5p,进一步的研究表明miRNA-150-5p可以作为MG患者病情严重程度的有效生物标志物,其中miR-27a-3p是表达唯一下调的microRNA,其结果与本试验研究结果相反,其产生原因可能有以下几点:(1)microRNA的表达具有组织器官特异性,胸腺中的细胞类型不同于外周血细胞,所以microRNA的表达量有所不同。(2)胸腺是中枢免疫器官,而外周血中的单核细胞等细胞属于外周免疫器官,二者在异常免疫调节和异常免疫应答中的作用机制不同,因此可能出现外周血和胸腺中的microRNA表达相反的情况,这同时可提示miR-27a-3p可能是胸腺特异性表达的microRNA,且其表达差异参与了MG的发生与发展。
参考文献略
联系客服