心肌肌钙蛋白 I 检测为什么难以标准化？

冯仁丰

201708

“在我活着的时间里，将不会实现心肌肌钙蛋白I检测的标准化”

Fred S. Apple

我已经选择了强调为什么心肌肌钙蛋白I（cTnI）检测看来决不会被标准化的争论。这不是说，我不希望出现标准化，但我想从科学的、以循证为基础的事实，说说这个心肌特定蛋白。我会考虑以下的分析, 我是一个热切的运动员。在六月的第二周，我每天早晨沿着河边跑步10公里。虽然，我每天跨越的的路是相同的，但每天早晨7点钟我观察到的是极其不同的。我被温度、风、伴随着闪电和打雷的下雨、在岩石裂缝里的水坑、覆盖的道路的树的枝条、以及因一个狐狸和两个黑熊出现在路上向上或向下走着等等。这个表现对cTnI的事情必须去考虑什么？

   

cTnI，是一个110个氨基酸残基的蛋白，具有一致的N-端序列，差异在于它来自骨骼肌形式，是心脏内肌原纤维的3个亚复合物（cTnI-CTnC-cTnT）的部分，具有特定的结构和调控功能（1）。因急性心肌梗死（MI）使细胞死亡后不久，cTnI从受伤的心肌中释放进入细胞外，在指示事件症状后的1~6小时，可在循环血液中检出cTnI（2）。数据说明，cTnI的循环主要与cTnC呈双复合物出现在急性MI的患者血液中，但也在血液中发现呈游离cTnI和三重复合物cTnICT。另外，有报道，游离的和复合的cTnI出现了C-和N-端蛋白水解的降解、氧化、和还原形式，以及磷酸化形式（3）。

    

使用抗-cTnI的单克隆抗体的免疫检测，对于每个检测方法取决于使用的抗体，识别决定簇区域。在cTnI分子内的蛋白区域，很容易被上述提及的修饰了—以及依赖决定簇的肝素的异变性质（4）、异嗜性抗体（5）、和自身抗体（6）的结合– 看来抑制了异变的免疫反应性，和甚至在某些情况下丧失反应性。免疫反应性的这样变异会导致在夹心法的cTnI免疫测定方法（使用捕获和检测抗体直接抗这些修饰区域）改变信号的产生。在早期MI后阶段，急性连续释放cTnI；同时在心肌组织和血液内进行着cTnI的修饰；又存在着对多种cTnI异构体不同清除基质和清除速率；所有上述在MI后的第一个24小时内累积一起，使没有2个患者的血液样品看来含有相同的cTnI异构体组成（7）。

另外，还有的实际问题，如溶血和温度的分析前影响，已经知道不同地影响检测。再有，高灵敏的检测已经开始改善了我们对健康个体内可检测的cTnI浓度的临床含义的理解（8），关于cTnI异构体的分布是否在人与人间一样，或是否在健康个体内它们保持着一样，我们还没有任何证据。例如，一些高灵敏的检测展示了在性别间有差异，有的没有差异。Wu等的早期研究，首先展示了市售检测试剂盒，对于依据cTnI多个复合物形式不同响应为基础的给定cTnI浓度产生了不同的相对响应（9）。这些资料说明，去比较不同厂商检测试剂盒得到的绝对浓度是不可能的。

   

cTnI的标准化不像确定和最佳的一级或二级参考物质那样简单。IFCC的心肌肌钙蛋白I标准化工作组的目标，看来被加倍了（10）：首先，形成以血清为基础的二级参考物质，通过参考检测程序为之定值；第二，依据长期校准溯源性，通过参考检测程序为该物质设定cTnI校准值。虽然，我称赞工作组的努力，并认为这些研究将会报告多篇发表的报告；但以下的争论建议工作组将看来达不到他们的目标。

实现真正的cTnI免疫测定标准化，统一采用抗体、包括捕获和检测/信号抗体二者的标准化，并适合所有厂商，这是要求的第一步。该目标看来实现不了。另外，即使相同抗体被用于相同厂商的不同平台（仪器），观察到这些不同平台的结果不协同的窘态（Dade Behring/Siemens 和Beckman Coulter市场上的cTnI检测看到的）。第二，需要制备一级校准/参考物质，以可接受的质谱分析方法学去确认这样物质的定值，建立短期和长期的稳定性。

尽管NIST成功地与AACC委员会合作，产生了SRM 2921，这是天然的cTnICT的三重复合物，由HyTest产生的，这个物质减少了13个检测产品间的检测变异＞40倍，到最好的，为2~3倍，并提供了亚最佳的一致性（11）。以SRM 2921物质为校准品，可使检测间有了一些溯源性，但是，从来没有可以让检测厂商要求使用这个物质。工作组一些成员的近期观察，通过免疫沉淀方法与荧光蛋白质印迹分析（Western blot）结合，与抗-cTnI单克隆抗体一起，说明NIST SRM 2921 cTnI物质在降解（12）。

正如这些作者说的，“这个发现进一步证实了在混合的阳性病人血清中cTnI的复杂性，如果降解开始就存在于患者样品、或发生于样品处理过程和储存时，则必须研究（12）。

工作组也叙述了依据多元小球为基础的免疫测定方法和SDS-PAGE的候选参考程序，声明可等摩尔检测游离cTnI、cTnIC双元复合物、磷酸化的和去磷酸化的游离cTnI、以及三重cTnICT复合物，不论有无肝素（13）。这些发现在使用HyTest的单克隆抗体（克隆560，可识别在氨基酸残基83~93的决定簇，和克隆19C7，可识别残基41~49的决定簇），在对于SRM2921标准化后被预示了。正如上述，但是，SRM 2921是出现了不同程度降解的趋势—这是工作组探索标准化中，没有被强调的一个重要事实。工作组报告了50 pg/ml的较低线性限值，较低的校准设定点为100 pg/ml，该浓度不适合用于高灵敏的cTnI检测（14,15），高灵敏试剂盒可检出浓度＜1 pg/ml，将很快用于临床实践。

结论是，我归到（于）我的看法。在我沿着相同的河流路线持续的早锻炼时，让我天天看到的各种表现从来不一样。同样，由于每个患者样品cTnI异构体自然的混合物，对相同患者血液使用不同的cTnI检测方法进行检测，将是不同的结果，所以，对于检测方法间cTnI浓度间的可比性，减少了我们近期和我们未来的信心。作为一个老年运动员，我的每天锻炼的差异没有令我烦恼，我却很愉快，因为我还能每个早晨去锻炼。实验室人员和临床医生，一样，应不要被cTnI标准化陷入困境。而是，他们应对选择的检测在临床和分析证据有明确理解，应为技术改善而高兴，因为可对较低的cTnI浓度有了精密的检出，也将导致较好的病人护理。

来源：微信公众号 冯仁丰