转：Notch信号通路与血管发育

【关键词】  血管形成; Notch信号; 血管发生

　　血管发育是复杂的血管网络形成的过程, 在个体发育、 组织再生、 肿瘤发生发展中发挥重要作用, 因此具有重要的研究价值。以往研究已经证明, 血管发育与细胞因子、 组织缺氧、 基因调控等多种因素有关。现就Notch信号通路在血管发育中的作用的研究进展作一综述。

　　1  Notch信号通路
    
　　Notch信号通路是进化中高度保守的信号转导通路, 其调控细胞增殖、 分化和凋亡的功能涉及几乎所有组织和器官［1］。哺乳动物中有4个notch基因, 编码4种Notch受体（Notch1, 2, 3, 4）。Notch前体蛋白经内质网O岩藻糖基转移酶(POFUT1)作用后, 在高尔基体中被Furin蛋白酶裂解成两部分, 二者通过非共价键相连, 形成细胞表面的异二聚体受体。胞外结构域（NECD）含29～36个EGF样重复序列（EGFlike repeats）和3个富含半胱氨酸的Notch/LIN12重复序列(Notch/LIN12 repeats),  其中, EGF样重复序列是配体结合所必需的,  而Notch/LIN12重复序列与抑制配体非依赖的Notch信号活化有关。胞内结构域（NICD）主要由核定位信号序列（NLS）, 6个串联的富含天冬酰胺的锚蛋白重复序列（tandem ankyrin repeats）和羧基端的PEST序列组成, 其中锚蛋白重复序列介导胞内结构域与下游信号分子结合, PEST序列有助于加速蛋白水解酶对NICD的降解。
    
　　目前在哺乳动物发现5种Notch配体, 分别为Deltalike1、 3、 4（Dll1、 3、 4）和Jagged1、 2（与果蝇Serrate/Lag2蛋白同源), 亦可被共同称为DSL（Delta/Serrate/Lag2）。该配体的胞外部分由氨基端的DSL结构域和下游数目可变的EGF样重复序列构成,  DSL结构域主要介导与受体的结合, 该结构域的泛素化是Notch配体活化的关键步骤, 这一过程需要E3泛素连接酶Mindbomb（Mib）的催化。另外, 泛素结合蛋白Epsin的活性是泛素化DSL发生胞吞作用, 进而激活Notch所必需的。
    
　　Notch信号的活化需要细胞间的直接接触。当配体与受体结合后, 激活金属蛋白酶家族的肿瘤坏死因子α转换酶(TACE), TACE切去受体的大部分NECD, 由此引发胞内结构域构象变化, 使之易受γsecretase/Presenilins作用发生第二次剪切, 最终释放NICD, NICD随即转移至核内, 与DNA结合蛋白RBPJ（又名CSL, 即哺乳动物中CBF1、 果蝇中Su(H) 、 线虫中LAG1的合称）结合。RBPJ与NICD结合之前为转录抑制因子, 结合NICD之后, RBPJ募集共激活分子, 进而启动Notch靶基因的转录。目前已知的Notch靶基因多为编码碱性螺旋环螺旋家族转录因子的基因, 包括Hes(Hairy/Enhancer of Split)和Hey(Hesrelated protein)。这些转录因子能够进一步调控下游分子的表达［1］。此外, Notch信号通路还存在一条不依赖RBPJ的途径, 这可能与细胞膜上另一类Notch受体, 即由未经剪切的完整Notch前体蛋白组成的受体有关［2］。

　　2  血管发育
    
　　胚胎发育早期分化出现成血管细胞（angioblasts）, 即内皮前体细胞（endothelial precursor cells, EPCs）, 融合后形成初级毛细血管丛, 这一过程称为血管发生（vasculogenesis）。随着发育的进行, 初级毛细血管丛改建为由不同等级的动静脉及毛细血管构成的血管网, 这一过程即为血管形成（angiogenesis）。血管形成起始于一部分内皮细胞的极性改变, 伸出丝状伪足, 获得迁移及侵袭能力。这些细胞被称为尖端细胞（tip cell）, 而其相邻的内皮细胞不发生此类变化。尖端细胞位于新生血管的最前端, 其丝状伪足向前伸展, 能够充分接受周围组织中各种生长因子的信号, 尤其是血管内皮生长因子A（VEGFA）［3］, 并受到周细胞（pericyte）的接触抑制及部分细胞外基质蛋白的调控。同时, 尖端细胞产生血小板源性生长因子（PDGF）, 为新生血管募集更多周细胞, 最终形成结构完整的血管［4］。尖端细胞伪足的伸展为血管新生指示了方向, 而真正形成结构完整功能健全的血管则需要管腔化（tubulogenesis）过程。以小鼠视网膜血管为模型的研究提示: 尖端细胞伪足间的相互接触及随即发生的胞体间的接触有可能形成一个桥样结构, 在这一结构中尖端细胞失去原有的特性, 形成连通的管道。组成管道壁的内皮细胞被称为茎细胞（stalk cell）, 紧邻尖端细胞位于其后方, 能够进行增殖, 促使血管芽及血管网的延长［5］。

　　3  Notch信号通路与血管发生

　　3.1  Notch信号与动静脉分化  既往认为, 内皮细胞的动静脉分化依赖血流物理学特性的调节。最近研究却表明, 血管内皮细胞的分化主要受Notch信号调控, 内皮细胞在有血流灌注之前即已形成其动静脉分化特征［6］。Lawson等的研究表明: 斑马鱼mindbomb基因的功能缺失突变抑制动静脉分化, 表现为动脉标记物EphrinB2在动脉内皮细胞中表达缺失。EphrinB2是一种相对分子质量较小的跨膜蛋白, 其受体EphB4为酪氨酸激酶受体, 通常作为静脉标记物仅表达于静脉系统, 而在mindbomb突变体的动脉内皮中却发现了EphB4的异位表达。反之, mindbomb在静脉中的过度活化导致ephB4的表达下调。形态学研究发现, mindbomb突变体存在明显动静脉畸形［7］。斑马鱼gridlock基因的功能缺失突变也能导致类似的变化, gridlock与哺乳动物hey2同源［8］。由于gridlock基因仅抑制静脉标记物的表达, 而并未增加动脉标记物的表达, 提示gridlock的功能在于抑制静脉分化, 而非促进动脉分化。在小鼠中, Notch信号通路也被证实为调控动静脉分化的主要通路。Notch通路中某些分子（如Rbpsuh, Hey1, Hey2）的功能缺失突变, 将导致出血, 背主动脉发育缺陷及动脉标志物的表达减少。类似的表现可见于敲除O岩藻糖基转移酶、 Dll4或Jagged1基因的小鼠［9］。

　　3.2  Notch信号与尖端细胞  Notch信号通路在尖端细胞的选择中起重要作用。Dll4在新生血管尖端有较高活性。尽管多数Dll4突变型个体在胚胎期即已死亡, 少数存活的个体却表现出内皮细胞过度增生, 血管分支数目增多, 血管密度明显升高, 尖端细胞标志物血小板源性生长因子b（Pdgfb）和神经生长因子受体（Netrin receptor, Unc5b）上调。应用重组可溶性Dll4/Fc蛋白或Dll4mAb封闭Dll4分子, 或应用γsecretase抑制剂DAPT抑制NICD形成也可以产生类似结果［10, 11］。在Rbpsuh水平阻断Notch信号的活化也能够导致尖端细胞数目增多, 新生血管出现异常分支, 同时, 实时影像研究显示, 生长中的斑马鱼体节间血管表现出增强的伸展行为［12］。上述研究提示, Dll4Notch通路能够抑制尖端细胞的形成, 从而减少由尖端细胞引导的血管分支的产生。
    
　　为了进一步了解Notch信号对尖端细胞结构功能的影响, 应用三维体外细胞培养系统的研究表明, 活化的Dll4Notch信号能够抑制VEGFA诱导的内皮出芽［13］。在过表达Dll4的实验性肿瘤中, 瘤体血流灌注良好, 血管分支及内皮细胞增生减少［14］。以上研究结果提示, 在血管发生过程中, 新生血管尖端的缺氧环境及VEGFA诱导一部分内皮细胞表达Dll4, Dll4作用于相邻内皮细胞膜上的Notch受体, 通过下调VEGFAR的表达维持此类细胞的静止状态, 而表达Dll4的细胞则获得尖端细胞的特性, 形成丝状伪足进一步接受更多VEGFA信号, 并引导新生血管沿VEGFA浓度梯度生长。Dll4与Notch协同作用保证血管发生适度而有序的进行。Notch信号在新生血管管腔化过程中的作用也得到了实验结果的支持, 过表达Notch4 NICD的小鼠表现出明显的血管腔扩大［15］, 提示Notch信号对血管出芽及分支的抑制作用可能促进了管腔化, 进而在血管发育过程中协调整合这两个过程。

　　3.3  Notch信号与血管平滑肌细胞的分化  既往研究结果表明, Notch抑制体外培养的平滑肌细胞分化, 这一作用可能与Hey2有关。然而, 最近更多的研究却提示: Notch信号能够诱导平滑肌细胞分化。Jagged1介导的Notch信号促进人主动脉平滑肌细胞及小鼠胚胎纤维母细胞的分化［16］。平滑肌细胞中的肌球蛋白重链及α肌动蛋白均被证实为Notch信号作用的靶分子。
    
　　当血管受损时, 血管平滑肌中各种Notch通路的分子表达水平发生变化, 如Notch1、 Notch3、 Jagged1、 Jagged2、 Hey1和Hey2。与未受损的对照组相比, 这些分子在损伤后最初2 d内表达下调, 在7～14 d内上调。体外培养完全敲除hey2的主动脉平滑肌细胞增生速度较野生型慢, 而过表达Hey1或Hey2的细胞增生速度加快, 同时细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂P27kip1（Cdkn1b）减少, 提示Hey2蛋白直接作用于P27kip1启动子抑制其转录［17］。在模拟循环血流的机械牵拉作用下, 体外培养的血管平滑肌细胞中Notch1和Notch3表达明显下调, 血管平滑肌分化标志物表达升高, 同时, 细胞增生减少, 凋亡增多。过表达Notch1或Notch3能够使上述细胞的增生及凋亡水平恢复［18］。上述研究提示, 循环血流机械牵拉作用抑制血管平滑肌细胞增生及促进凋亡的作用受到Notch信号通路的调节。

　　3.4  Notch信号与成体动脉形成  在成体循环系统中, 当局部动脉血流受阻时（如血栓栓塞, 动脉粥样硬化性血管狭窄等）, 受阻动脉发出侧支血管, 以重建缺血组织的血流供应, 这一过程被称为动脉形成（arteriogenesis）, 它以局部增加的血流剪应力为起始因素, 还涉及炎细胞活化, 内皮增生及细胞外基质重塑等［19］。最近的研究表明, Dll1是动脉形成的关键调控分子。Dll1仅在动脉内皮中表达, 并于局部缺血诱导的新生动脉中表达上调。在Dll1杂合子的后肢缺血模型中发现其动脉侧枝生成减少, 血流重建不完全［20］, 同时, 由缺血诱导的Notch信号活化及EphrinB2表达上调均受到抑制。类似的表现也出现于Notch1杂合子中［21］。

　　3.5  Notch信号与肿瘤血管生成  在多数实体瘤中, VEGFA表达明显升高。应用VEGFAmAb能够抑制啮齿动物肿瘤的生长。然而在前期临床实验中, VEGFAmAb与传统化疗结合应用仅能提高患者总体生存率, 部分肿瘤耐药［22］。鉴于Notch信号通路在血管发育中的关键作用, 及Dll4在VEGFA依赖的新生肿瘤血管中的高水平表达, 可将Dll4作为抗肿瘤药物的新靶点。在小鼠异种移植肿瘤模型中, 应用Dll4mAb, Dll4/Fc融合蛋白, 或γsecretase抑制剂均能够抑制瘤体生长, 新生肿瘤血管尽管分支数目增加, 血管密度增大, 但是血管功能低下, 导致肿瘤组织血流灌注减少, 呈缺氧状态。此外, 抗Dll4治疗也可抑制VEGF抑制剂耐药实体瘤的生长［14］。

　　3.6  Notch信号与血管病变  Alagille syndrome（AGS）是一种常染色体遗传性疾病。病变主要累及肝脏、 心脏、 眼和骨骼。多数AGS患者存在JAG1基因突变, 少部分为Notch2突变［23］。发病机制可能与Notch信号对心脏神经嵴细胞（cardiac neural crest cells）向血管平滑肌细胞分化的调控相关。
    　　
　　伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病 (CADASIL)是一种反复发作缺血性脑卒中,  逐渐出现多发性脑梗死和痴呆的非动脉硬化性、 非淀粉样变性脑血管病。其主要病理表现为血管平滑肌细胞的进行性变性及嗜锇颗粒（GOM）沉积。Notch3在CADASIL发病过程中的重要性已经得到公认, 但其具体的发病机制是由于Notch3 介导的信号缺失［24］,  还是由于Notch3 胞外区域不能有效被清除目前尚不能确定。嗜锇颗粒是否由过量积聚的Notch3胞外区域所组成也存在争议。目前研究发现, 在大多数Notch3相关的的CADASIL患者中, 存在由Notch3基因的错义突变而导致的胞外34个EGF样重复序列中的一个序列增加或缺少一个半胱氨酸残基, 打破了原有的二硫键的形成,  改变了蛋白质构象,  干扰了受体与配体之间的相互作用, 也可能导致了受体胞外区域在血管平滑肌细胞的堆积。这一发现在一定程度上提示了CADASIL的发病机制。

　　4  展望
    
　　目前已有大量研究证实了Notch信号通路在血管发生各个阶段中的作用, 如对尖端细胞的选择, 诱导动静脉分化及促进平滑肌细胞分化。然而, Notch信号通路在这些过程中的具体作用机制目前还不清楚, Notch与其他信号通路之间是否存在相互作用及其作用机制尚不明确。Notch信号通路在血管发生过程中是否存在其他重要作用仍需进一步研究。此外, 鉴于实体瘤生长转移对血管发生的依赖性, 对Notch通路中各个关键分子的研究为抑制肿瘤血管发生及肿瘤生长提供了新靶点。Dll4是目前发现的Notch通路中最有应用前景的抗肿瘤靶点, 是否存在其他与肿瘤血管发生密切相关的分子, 以及这些分子的应用价值仍有待发现。另外, Notch信号与某些先天性疾病的关系为阐明此类疾病的发生机制及开发治疗新方法提出了可能。

【参考文献】
  　　［1］ ArtavanisTsakonas S, Rand MD, Lake RJ. Notch signaling: cell fate control and signal integration in development［J］. Science, 1999, 284: 770-776.

　　［2］ Mrtinez A, Zecchini V, Brennan K. CSL independent Notch signalling: A checkpoint in cell fate decisions during development?［J］. Curr Opin Genet Dev, 2002, 12: 524-533.

　　［3］ Ralf H, Adams, Kari A. Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis［J］. Nat Rev Mol Cel Bio, 2007, 8: 464-478.

　　［4］ Gerhardt H, Golding M, Fruttiger M, et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia［J］. J Cell Biol, 2003, 161: 1163-1177.

　　［5］ Cristina R, Ralf H, Adams. Regulation of vascular morphogenesis by Notch signaling［J］. Genes Dev, 2007, 21: 2511-2524.

　　［6］ Jones EA, Le Noble F, Eichmann A. What determines blood vessel structure?Genetic prespecification vs.hemodynamics［J］. Physiology, 2006, 21: 388-395.

　　［7］ Lawson ND, Scheer N, Pham VN, et al. Notch signaling is required for arterialvenous differentiation during embryonic vascular development［J］. Development, 2001, 128: 3675-3683.

　　［8］ Zhong TP, Childs S, Leu JP, et al. Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery［J］. Nature, 2001, 414: 216-220.

　　［9］ Shi S, Stanley P. Protein Ofucosyltransferase 1 is an essential component of Notch signaling pathways［J］. Proc Natl Acad Sci, 2003, 100: 5234-5239.

　　［10］ Hellstrm M, Phng LK, Hofmann JJ, et al. Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis［J］. Nature, 2007, 445: 776-780.

　　［11］ Leslie JD, ArizaMcNaughton L, Bermange AL, et al, Endothelial signaling by the Notch ligand Deltalike 4 restricts angiogenesis［J ］. Development, 2007, 134: 839-844.

　　［12］ Siekmann AF, Lawson ND. Notch signalling limits angiogenic cell behaviour in developing zebrafish arteries［J］. Nature, 2007, 445: 781-784.

　　［13］ Sainson RC, Aoto J, Nakatsu MN, et al. Cellautonomous Notch signaling regulates endothelial cell branching and proliferation during vascular tubulogenesis［J］. FASEB J, 2005, 19: 1027-1029.

　　［14］ NogueraTroise I, Daly C, Papadopoulos NJ, et al. Blockade of Dll4 inhibits tumour growth by promoting nonproductive angiogenesis［J］. Nature, 2006, 444: 1032-1037.

　　［15］ Uyttendaele H, Ho J, Rossant J, et al. Vascular patterning defects associated with expression of activated Notch4 in embryonic endothelium［J］. Proc Natl Acad Sci, 2001, 98: 5643-5648.

　　［16］ Doi H, Iso T, Yamazaki M, et al. Jagged1selective notch signaling induces smooth muscle differentiation via a RBPJkappadependent pathway［J］. J Biol Chem, 2006, 281: 28555-28564.

　　［17］ Harvrda MC, Johnson MJ, O’Neill CF, et al. A novel mechanism of transcriptional repression of P27kip1 through Notch/HRT2 signaling in vascular smooth muscle cells［J］. Throm Haemost, 2006, 96: 361-370.

　　［18］ Morrow D, Sweeney C, Birney YA, et al. Cyclic strain inhibits Notch receptor signaling in vascular smooth muscle cells in vitro［J］. Circ Res, 2005, 96: 567-575.

　　［19］ Heil M, Eitenmuller I, SchmitzRixen T, et al. Arteriogenesis versus angiogenesis: Similarities and differences［J］. J Cell Mol Med, 2006, 10: 45-55.

　　［20］ Limbourg A, Ploom M, Elligsen D, et al. Notch ligand Deltalike 1 is essential for postnatal arteriogenesis［J］. Circ Res, 2007, 100: 363-371.

　　［21］ Takeshita K, Satoh M, Ii M, et al. Critical role of endothelial Notch1 signaling in postnatal angiogenesis［J］. Circ Res, 2007, 100: 70-78.

　　［22］ Jain RK, Duda DG, Clark JW, et al. Lessons from phaseⅢ clinical trials on antiVEGF therapy for cancer［J］. Nat Clin Pract Oncol, 2006, 3: 24-40.

　　［23］ McCright B, Lozier J, Gridley T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency［J］. Development, 2002, 129: 1075-1082.

　　［24］ Haritunians T, Boulter J, Hicks C, et al. CADASIL Notch3 mutant proteins localize to the cell surface and bind ligand［J］. Circ Res, 2002, 90: 506-508.