SNPs的知识

  单核苷酸多态性即SNPs是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A，G，C，T）替换而引起的多态性，它是一种单核苷酸的变异，是继限制性酶切片断长度多态性即RFLP（restriction fragment length polymorphism）以及可变数重复序列即VNTR（variable number of tandem repeat）和微卫星多态性（microsatellite polymorphism）之后的又一新一代多态性遗传标记，自从1994年第一次被提出之后，它渐渐成为与分子标记有关各领域研究的焦点.

  作为第三代遗传标记，SNPs在基因组中具有高密度和高保守的特点，人类30亿个碱基中每千个碱基出现一次，初步估计在整个基因组共有300万以上的SNPs.大多数SNPs位于基因组的非编码区，并且有些位于基因组编码区的SNPs所致编码序列的改变并不影响翻译后的氨基酸序列，这种SNPs对个体的表现型是无影响的.但是有的SNPs位于基因启动子中，导致基因转录活性的上升或下降，造成该蛋白的表达量上升或下降，进一步影响其生物学活性.有些位于蛋白质编码区的SNPs可能影响翻译后关键的功能基团的氨基酸序列，从而影响蛋白质的功能，最终导致对特定环境或病因的反应敏感性.目前很多机构都在检测SNP，做SNP图，建立SNP与各种疾病之间的联系，如果得出某些SNP或某些SNP的特定组合与特定疾病、特定地区发病人群乃至个别患者有明显相关性，疾病的诊断和治疗将可以更有针对性，甚至做到个体化.近几年来，SNP筛查在遗传病的研究，药学的应用研究，以及肿瘤研究中都得到应用.

  ３ MMPs与肿瘤转移的关系

3.1 肿瘤转移 肿瘤转移是制约临床治疗效果的一种恶性生物学行为[131-136]，是造成肿瘤患者死亡的主要原因.肿瘤转移包括一系列过程，必须多次穿透基底膜(basement membrane,BM)，细胞外基质(extral cell matrix,ECM)等，其中细胞外基质的降解和改变是肿瘤转移和血管生成的基本条件，因为肿瘤细胞必须具备降解细胞外基质，基底膜，甚至间质基质的能力，才能向周围浸润，并向血管、淋巴管及远处转移.其中ECM和BM的降解需要多种基质降解酶即MMPs的协同参与才能完成，因此患者肿瘤组织中MMPs的含量和肿瘤的转移往往呈相关性.
3.2 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶即MMPs是一类依赖锌离子的蛋白水解酶，迄今为止已经发现了26种.MMPs能够降解细胞外基质和基底膜，参与许多生理和病理过程，是肿瘤浸润转移过程中最重要的调控分子之一，涉及肿瘤浸润和转移，血管的生成，在肿瘤的发展中起关键作用.现已在多种人类肿瘤中检测到MMPs的存在，并显示与肿瘤浸润转移力呈正相关.如早期肝癌和甲状腺癌中有MMP-1的表达，在人类结肠癌中MMP-2，MMP-7和MMP-9均过量表达，在乳腺癌中，已检测到MMP-8，MMP-9和MMP-11并且有望作为肿瘤转移诊断标记.有实验表明，表达MMP-9的乳腺癌肿瘤的浸润和转移发生较早，预后差[137-162].
SNP作为近几年来兴起的第三代分子遗传标记，具有密度大，遗传性稳定的特点.MMPs家族部分成员的启动子已经测序，分子水平的调控研究，尤其是对其启动子SNP的研究已经展开并取得进展，本文的后半部分将对此做一阐述.总之，研究MMPs基因的SNP现象，为进一步从转录水平了解MMPs的作用机制提供了一个很好的方向.

SNP在疾病中的研究

MMPs中有关SNP的研究
4.1 MMP-1启动子中SNP研究现状 MMP-1是少数可以降解I型以及III型胶原的酶之一，I型和III型胶原是构成胞外基质的主要成分，与肿瘤细胞的侵袭有密切关系[163-165].MMP-1启动子在－1607存在一个SNP，分别为5’-GAT-3’(1G)和5’-GGAT-3’(2G).Walter et al[166]应用PCR-RFLP方法研究了31例黑色素瘤转移病例的MMP-1启动子序列－1607位点1G/2G多态性，发现在11 q22.23(MMP-1基因的所在位点)处的杂合性缺失（loss of heterogene,LOH）与2G基因型有关：在12例有LOH的黑色素瘤患者中，83%保留有2G基因型，17%保留有1G基因型.由此推测2G基因型与肿瘤的浸润和转移有关.
Zhu et al[167]应用PCR-RFLP方法研究MMP-1启动子－1607位点SNP现象发现，2G/2G基因型提高了MMP-1的转录活性，因此2G/2G个体更易患肺癌，尤其在吸烟个体中危险更高.研究还发现：2G/2G个体比1G/1G或1G/2G个体更易提早发展为肺癌.
Nishioka et al[168]利用PCR和测序结合法分析了23例子宫颈上皮肿瘤（cervical intraepithelial neoplasias, CIN）标本和86例子宫颈癌（cervical cancer）标本的MMP-1启动子-1607 SNP，并进行统计学分析，发现MMP-1启动子2G SNP和MMP-1的表达之间存在相关性，并和子宫颈癌的临床分期有关.这表明MMP-1启动子的2G SNP可能影响MMP-1基因的转录活性，进而影响子宫颈癌的侵袭和浸润活性.
但也许SNP的作用效果在不同人群中存在差异，据Ju et al[45]报道：用TaqMan法对韩国232例子宫颈癌患者血液和332例健康对照个体血液进行MMP-1启动子－1607位点SNP分析发现：2G频率在子宫颈癌患者中为66.1%，而在对照组中为68.2%，二者之间没有明显差异.因此，2G SNP既不导致韩国妇女对子宫颈癌易感，又不促进子宫颈癌的发展.
Matsumura et al[169]用PCR-RFLP法分析了215个胃癌患者和166个健康对照个体，发现二者1G/2G的比率接近，并且无论在肿瘤的侵袭程度，淋巴结转移，和临床分期上都无明显的差别.但另一方面，发现SNP和胃癌患者的组织分化和性别分布有着显著关联（P＜0.05），由此可见，MMP-1的启动子中2G等位基因的存在并不会提高患胃癌的危险，但是可以对胃癌的分化产生影响.
Wyatt et al[170]利用PCR和测序结合法测定34例人类包皮成纤维细胞中MMP-1启动子1G/2G多态性和相应MMP-1蛋白表达水平之间的关系，结果表明2G SNP的存在并不会显著提高MMP-1蛋白的含量，但是会提高MMP-1基因对外界刺激因子（如细胞因子，生长因子）的敏感性.此外可以采用PCR和测序结合法发现新的SNP位点，如Jurajda et al[171]应用PCR和测序结合法发现了MMP-1启动子中一个新的SNP位点：159A/G，通过对该位点和已经发现的1607 1G/2G的连锁分析发现A等位基因常和－1607的2G等位基因连锁，而G等位基因则常和1G等位基因连锁，从而为以后研究MMP-1表达在肿瘤转移中的意义提供了一个新的方向.
另外，关于MMP-1在转录水平调控机制的研究也早已展开.研究表明MMP-1的表达受有丝分裂素激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）途径的调控，MAPK途径由三部分组成，分别是胞外信号调控激酶（extracellular signal regulated kinase,ERK），p38和c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）.它们都是以核转录因子家族活性蛋白－1（activated protein-1 AP-1）和ETS转录因子家族为底物的.MMP-1启动子-1607位点的2G SNP提供了一个ETS结合位点，和－1602位点的AP-1结合位点共同作用，促进MMP-1的转录，因此，2G SNP与1G SNP相比，MMP-1的转录活性提高[172，173].黑色素瘤细胞系A2058是一个2G纯合体，具有高水平的MMP-1组成型表达.Tower et al[172]利用Northern blotting，Western blotting，荧光素酶活性分析和PCR为基础的定点突变方法研究发现，如果加入一个针对ERK途径的特异性抑制剂PD098059，则MMP-1的表达受阻，由此可见ERK1/2途径主要以MMP-1的2G多态型为靶点，促进MMP-1基因的转录，从而提高相应肿瘤细胞的转移能力.Tower et al[174]再次用乳腺癌细胞MCF-7/ADR研究发现，AP-1位点在2G SNP存在的情况下可以提高MMP-1基因的转录活性，相反在1G SNP存在的情况下则抑制MMP-1基因的转录，从而抑制I型胶原的降解，最终降低了MCF-7/ADR细胞的侵袭能力.可见，2G SNP和ERK1/2途径以及AP-1位点共同协作促进MMP-1的高表达，最终导致乳腺癌细胞的侵袭能力提高.
同样Tower et al[175]发现FRA-1（Fos-like region antigen）和AP-1转录因子共同促进A2058中MMP-1蛋白的表达.抑制FRA-1，与1G SNP相比，会明显下调含2G SNP的MMP-1启动子的转录活性.
Zinzindohoue et al[176]研究了结肠癌患者的MMP-1启动子2G/2G基因型与患者存活率之间的关系发现，具有2G/2G基因型的各个临床分期患者和同期非2G/2G基因型患者相比较都具有显著较低的存活率，统计分析结果是：I期和II期，P＜0.01；从I期到III期，P＜0.001；总体，P＜0.04.因此，经过临床阶段，年龄，以及化疗辅助各方面因素的校正后，2G SNP可以作为独立的诊断结肠癌不良预后的指标.而同时进行的MMP-3启动子SNP和结肠癌存活率相关性研究则表明，二者无显著相关性.
4.2 MMP-3中SNP研究现状 MMP-3可以降解层黏连蛋白和纤黏连蛋白，对肿瘤发生和肿瘤生长具有重要意义.MMP-3启动子－1171位点存在5A/6A的多态现象. Krippl et al[177]应用Taqman荧光标记法对500例已经组织确诊为乳腺癌的患者和500个健康对照个体做了MMP-3启动子的SNP研究，发现5A/5A、5A/6A、6A/6A三种基因型在患者和对照中的分布大致相似，其中患者分别为20.6%、51.8%、27.6%，而对照则分别为23.3%、47.3%、29.4%.但患者中基因型为5A/5A者和5A/6A或6A/6A相比有较高的淋巴结转移率，因此MMP-3启动子的5A/6A多态性不会影响个体对乳腺癌的易感性，但是会提高患者的癌细胞转移能力.
Zhang et al[178]用PCR-RFLP方法分析了中国北方417位患者，其中食道鳞细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）234例，胃贲门腺癌（gastric cardiac adenocarcinoma，GCA）183例，以及350例健康对照个体的MMP-3启动子的5A/6A SNP，发现ESCC患者中SNP至少含一个5A等位基因的个体具有明显的淋巴转移倾向，而在GCA患者中却没有观察到，因此MMP-3的5A SNP和ESCC的肿瘤发展以及淋巴转移有关.