冷冻电子显微镜技术(cryoelectron microscopy)是从20世纪70年代提出的,经过近10年的努力,在80年代趋于成熟。它的研究对象非常广泛,包括病毒、膜蛋白、肌丝、蛋白质核苷酸复合体、亚细胞器等等。
一方面,冷冻电子显微镜技术所研究的生物样品既可以是具有二维晶体结构的,也可以是非晶体的;而且对于样品的分子量没有限制。因此,大大突破了X-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量(小于100KDa)样品的限制。
另一方面,生物样品是通过快速冷冻的方法进行固定的,克服了因化学固定、染色、金属镀膜等过程对样品构象的影响,更加接近样品的生活状态。
21世纪初,冷冻电子显微镜都具备自动图像采集系统。CCD(charged-couple device)照相机能快速、动态的记录电子衍射图,但由于像素的限制,其分辨率不如照相胶片。CCD和照相胶片所记录的是生物样品空间结构的二维投影,利用各种计算机软件程序包,可以从电镜的二维图像重构样品的三维结构,即三维重构。已开发出许多软件程序包可供计算机处理使用,大大方便了生物样品的结构重构。[1]
用于冷冻电镜研究的生物大分子样品必须非常纯净。生物样品是在高真空的条件下成像的,所以样品的制备既要能够保持本身的结构,又能抗脱水、电子辐射。一种方法是通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态,也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。该方法有两个关键步骤:
一是将样品在载网上形成一薄层水膜;二是将第一步获得的含水薄膜样品快速冷冻。在多数情况下,用手工将载网迅速浸入液氮内可使水冷冻成为玻璃态。其优点在于将样品保持在接近“生活”状态,不会因脱水而变形;减少辐射损伤;而且通过快速冷冻捕捉不同状态下的分子结构信息,了解分子功能循环中的构象变化。
另一种方法是通过喷雾冷冻装置(spray-freezing equipment),利用结合底物混合冰冻技术 (spray-freezing),可以把两种溶液(如受体和配体)在极短的时间内混合起来 (ms量级),然后快速冷冻,将其固定在某种反应中间状态,这样能对生物大分子在结合底物时或其他生化反应中的快速的结构变化进行测定,深入了解生物大分子的功能。
一般情况下,用感光胶片记录图像。感光胶片和CCD记录的都是样品在垂直于电子束方向的二维投影像。由于象素的限制,SSCCD(slow-scan charged-coupled device)照相机拍摄的图像的分辨率不能和胶片记录的图像相比较,但是能更快速的反馈信息,因为胶片只有从电镜中取出,经化学处理后才能观察。而且SSCCD在记录动态变化、线性、背景噪音等方面优于感光胶片。
一些因素如:辐射损伤、电子束诱导的样品漂移和放电、电子束不均一等都能引起图像质量的下降。低剂量照相技术能尽可能的减少电子束辐射损伤;而将样品保持在液氦的温度能进一步的保护样品。
具有200KV或更高加速电压并装备场发射枪(field emission gun)的现代电镜较100kv加速电压和热发射枪(thermionic electron gun)的传统电镜有很大的优越性。场发射枪产生的电子束具有更好的时间、空间一致性,提高CTF;高加速电压能减少电子束诱导的样品漂移和放电。冷冻含水生物样品由于没有经过化学固定、染色、金属镀膜,所获得的图像反差小。
冷冻含水样品电镜图像的反差取决于样品本身的散射反差、冰的厚度和物镜的欠焦量等因素。样品本身的散射反差与样品结构有关,是无法改变的。冰层过厚与支持膜过厚一样会降低反差,因此其厚度必须适当。改变物镜欠焦量可以改变图像的反差。欠焦下得到图像在光学上是失真(optical distortion)的(用CTF描述),在进行中、高分辨率的图像分析时必须校正。在任何欠焦水平,总有一些图像信息会丢失,因此需要在不同的欠焦水平下拍摄大量图像,加以合成以弥补单一图像丢失的信息。
数据处理的最终目的是为了获得生物样品的三维质量密度图。由于冷冻电镜获得图像信躁比低,结构信息常常淹没在躁声中而难以辨认。只有通过大量拍摄生物样品的同一个图像,然后用某种方法加以平均来消除躁声。由二维图像推知三维结构的方法即三维重构。其理论原理是中心截面定理: 即一个函数沿某方向投影函数的傅里叶变换等于此函数的傅里叶变换通过原点且垂直于此投影方向的截面函数。在1968年由De Rosier和 klug提出。由于样品的性质和有无对称结构的不同,图像分析的方法也有差异。但对于所有的生物样品都有三个基本的任务要解决:
第一,必须得到不同方向的样品图像;第二,计算确定样品的方向和中心并不断加以优化;第三,无论在傅立叶空间还是真实空间,图像的移位必须加以计算校正,以使样品所有的图像有共同的原点。
基于以上几点,人们建立了三种解析生物大分子的基本方法:
一是电子晶体学(electron crystallography),利用电子与晶体的相互作用研究生物大分子的结构;
二是单粒子法(single paticle analysis),根据大量不同取向的相同颗粒的电子显微图像,重构生物大分子的结构;
三是电子断层学(electron tomography),根据样品在一系列不同的倾斜角度下的多个电子显微象进行三维重构。[3]
冷冻电子显微镜技术的快速发展,使其在生物大分子的结构研究中得到越来越广泛的应用。对于具有二维晶体结构的生物样品,能够得到其高分辨率的三维重构图像,并直接用于解析其空间结构信息;对于非晶体的样品,虽只能得到低分辨率的三维重构图,但可以为高分辨率的X-射线晶体学和核磁共振波谱学所得到的亚结构提供模型。此外,通过捕获样品在不同状态的结构信息,研究其构象的动态变化与其功能的关系。本文从样品准备、数据采集、数据处理等步骤,对冷冻电子显微镜技术在生物大分子的三维结构研究中的应用进行综述,并举例说明这项技术的优越性。
联系客服