（文章篇）S5E03：宿主通过microRNA调控肠道微生物多样性

在上一期中，我们选取了一篇Cell介绍了肠道微生物菌群通过代谢饮食中胆碱类物质产生TMAO导致血小板超反应性，最终影响病人血栓风险，然后总结了宿主与肠道微生物之间互相作用的几个方面（点击查看），今天反过来，我们以这篇文章为例：The Host Shapes the Gut Microbiota via Fecal MicroRNA.Cell Host Microbe（IF 12.3 ）. 2016 Jan 13;19(1):32-43. doi: 10.1016/j.chom.2015.12.005.看microRNA在宿主调控肠道微生物中的作用。

先看文章的模式图：

文章主要发现：

1. microRNA是啮齿类和人粪便的重要组成成分；

2. 粪便中microRNA的主要来源是小肠上皮细胞和Hopx+细胞；

3. microRNA通过进入细菌并调控细菌基因表达，从而影响细菌生长；

4. 粪便microRNA对于维持肠道菌群正常至关重要；

下面我们根据文章的fig顺序介绍文章思路：

一、粪便中microRNA的分离、鉴定

• 作者首先分离了小鼠和人粪便中的RNA，并对RNA大小进行测定，然后通过nanostring数字表达谱芯片（关于该技术的介绍点击查看）对其中的microRNA进行检测，从小鼠566条microRNA中检测到了283条microRNA，人的800条microRNA中检测到了181条，其中有17条microRNA在两个物种中共同检测到；

• 考虑到囊泡然后分析了胞中microRNA的表达，发现两者microRNA表达谱有较高的一致性；

• 进一步对不同肠道区域的microRNA进行检测，结果发现microRNA含量与菌群含量成反比；

二、明确粪便中microRNA的主要来源细胞

• 由于小肠上皮细胞 (IECs)可以分泌囊泡（囊泡），而Villin蛋白是IEC的标识蛋白，因此作者构建了Vil-CreTg/Dicer1fl/fl敲除小鼠，以特异性敲除IEC中DICER酶，而DICER酶是microRNA产生过程中的关键蛋白，并比较敲除组与对照组小鼠粪便中microRNA的差异；

• 然后，作者又用同样的方式对Paneth cells和goblet cells中DICER进行敲除，并比较敲除组与对照组小鼠粪便中microRNA的差异；

• 结果发现IEC和Hopx+细胞是microRNA的主要来源，而且两者产生的microRNA是不同的。

• 当然，作者排除了淋巴细胞产生microRNA的影响；

三、IEC细胞的microRNA缺陷组小鼠的肠道微生物菌群失衡

• 然后作者通过MiSeq平台进行16SrRNA基因V4区进行测序，以检测分析Dicer1DIEC组与对照组肠道微生物菌群，并分析两组微生物β多样性，结果发现Dicer1DIEC组与正常组小鼠相比，肠道菌群的物种组成发生较大变化，而且组内样品间差异也较大。

四、宿主microRNA影响微生物生长

• 作者选取了Fusobacterium nucleatum (Fn)和大肠杆菌E.coli作为菌株研究，并通过两菌的序列进行microRNA序列比对，结果发现了包括hsa-miR-1226-5p，hsa-miR-1226-5p等在内的microRNA靶基因结合序列，并通过qPCR进行验证发现这些microRNA在宿主粪便中存在；

• 然后，进行了两菌的体外培养，并进行了microRNA mimics和非特异性序列干预，结果发现mimics干预组的菌生长增快；

五、宿主microRNA进入细菌并干预细菌RNA表达

• 作者通过GFP标记菌和cy3标记microRNA，并通过荧光显微镜观察microRNA在细菌中的定位，结果发现microRNA与细菌的核酸共定位；

• 然后进行microRNA和突变序列干预，并检测16srRNA、yegH、RNaseP、rutA 等mRNA的表达和细菌的扩增，结果发现相关microRNA不仅促进增殖，还调控相应RNA的表达；

  

六、野生型小鼠粪便microRNA移植给IEC microRNA缺陷小鼠，恢复其菌群多样性

• 为了进一步证明microRNA调控小鼠肠道菌群中的角色，作者将野生型小鼠粪便microRNA移植给IEC microRNA缺陷小鼠，并通过16SrDNA多样性和qPCR检测接受者小鼠微生物多样性，结果发现抑制后小鼠菌群恢复了野生型小鼠的菌群多样性。

• 进一步的，为了证明某些特定的microRNA可以体内调节菌群变化，作者将人工合成的microRNA通过饮水饲喂小鼠，结果发现小鼠粪便中E.coli丰度增加。

七、野生型小鼠粪便microRNA移植RescueDicer1DIEC缺陷小鼠的DSS结肠炎

• Dicer1DIEC缺陷小鼠LT-β,Zo-1等蛋白表达下调使其更易于的结肠炎，于是作者首先建立DSS结肠炎模型，然后将野生型小鼠粪便的RNA抑制给模型小鼠，结果发现：RNA的移植成功Rescue了DSS结肠炎的表型。
  

文章到此就结束了，最后理一下这篇文章的亮点：

1. 宿主与肠道菌群相互作用，菌群可以通过代谢物等影响宿主，宿主也通过饮食、药物等影响菌群，这篇文章选的是大家非常熟悉的microRNA为宿主调控肠道菌群的关键分子；

2. 在鉴定到microRNA以后，为了确定其来源，作者同样检测了囊泡/外泌体中microRNA的表达，并以此推断microRNA的来源细胞，我们在第四季介绍过外泌体，大家可以查看；

3. 为了验证宿主粪便microRNA对菌群的影响，作者完成几部分实验：16S rRNA多样性测序加分析、DICER酶细胞特异性敲除小鼠、粪便RNA移植实验等等，这些实验是我们在做肠道微生物研究时常用的。

4. 关于微生物多样性的测序分析，我们没有展开介绍，下次请依凡为大家系统介绍相关实验流程和分析。

最后，为了感谢大家对我们的支持，我们正在整理前面发过的文章，以方便大家在电脑上查看。

That’s all. Thank you!

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