近期很多人留言，想整理一篇5分的文章。虽然前期我们讲了很多，可能显得过于套路化，那就让我们细细来看一篇Cell Death and Disease（IF 5.3）文章的构成吧。
Epstein-Barr virus-encoded miR-BART6-3p inhibits cancer cell metastasis and invasion by targeting long non-coding RNA LOC553103
下载链接：http://pan.baidu.com/s/1pLNErgB
在鼻咽癌中EB病毒能编码44个成熟的miRNAs。这些miRNAs中，有些会通过靶向宿主基因或自身病毒基因来促进肿瘤生成。本文作者发现了一个miRNA，EBV-miR-BART6-3p（BART6）,通过逆转上皮间质转化（EMT）抑制EBV相关肿瘤细胞的迁移浸润。随后，通过芯片分析发现，一个新的lncRNA-LOC553103能被BART6下调。LOC553103过表达能促进癌细胞迁移浸润。这表明，BART6通过抑制LOC553103表达阻遏癌细胞迁移浸润。
1、BART6的选择与功能
在鼻咽癌中筛选了44个BART转录本转录的EBVmiRNAs。接着分别转染这些miRNAs到HEK293T细胞中，发现BART6过表达后能改变HEK293T细胞的形状，细胞伪足变短或消失（伪足是细胞迁移的必要条件，这暗示着BART6能抑制细胞迁移）。
转染实验发现EBV-细胞中，BART6表达量要高，而在EBV+细胞中，BART6的表达量要少于对照组。
Transwell实验发现，转染BART6的细胞其迁移速度与浸润能力显著下降。这表明BART6能抑制上皮肿瘤细胞的迁移与转移。
2、BART6下游分子机制
第一部分内容已经表明，BART6有抑癌作用，能抑制癌细胞的侵袭。那这背后的机制是什么呢？这是作者接下来所关心的问题。
作者通过生物信息学预测（Reptar software ，http://reptar.ekmd.huji.ac.il/。 RNAhybrid software ， http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/ ），发现有738个基因跟BART6有结合的可能（MFE <-20.0，minimum free="">
这里通过MFE用来表征miRNA与其靶点mRNA结合的程度，负值的绝对值越大，则结合越紧密，结构越稳定。
但挑选的两个分子TUSC2、VANGL2在转染BART6的情况下，其表达量变化不大。那怎么办呢？接着作者通过全基因组芯片分析，其中含有已知mRNA或lncRNA的探针，来确定由BART6引起的基因失调。接着又是不断的筛选，最终锁定在三个lncRNA分子上，LINC00461、SRGAP2-AS1、LOC553103，这三个lncRNA均显著被下调，并且都含有BART6预测结合位点。最终发现，只有LOC553103在三种细胞株中均被BART6下调。
目标分子找到了，接着是荧光素报告基因实验和一个rescue实验（点击查看（策略篇）S5E56: 大名鼎鼎的Rescue挽救实验，是个什么鬼？）。
这部分实验证明了BART6能与LOC553103直接结合，并导致后者的表达下调。
实验发现，在EBV-细胞中，过表达BART6能增加上皮markerCDH1的表达，下调间质markerCDH2、转录因子β-catenin和Snail的mRNA水平，并且能抑制转移浸润相关基因MMP9、MMP2的表达。
既然BART6与转移相关，那么看看BART6下游的靶蛋白作用情况。作者就检查了BART6影响的一些转移相关蛋白，尤其是EMT的marker（傍大款嘛，找些明星分子做一下）。
实验发现，在EBV-细胞中，过表达BART6能增加上皮markerCDH1的表达，下调间质markerCDH2、转录因子β-catenin和Snail的mRNA水平，并且能抑制转移浸润相关基因MMP9、MMP2的表达。
3、体外实验（细胞实验）
目标分子找到后，就是看的功能了。
干扰LOC553103观察细胞的表型变化。
实验表明，干扰LOC553103使得癌细胞迁移变慢，浸润能力减弱。这个功能跟上调BART6一致。过表达LOC553103则能促进癌细胞迁移，其浸润能力也增强，这逆转了BART6过表达所产生的细胞表型。这部分实验均暗示了BART6通过结合并下调LOC553103来抑制癌细胞的转移侵袭作用。
4、体外实验（动物实验）
过表达BART6、敲除LOC553103能抑制肿瘤的转移。
5、 最后，作者加了一点细胞实验内容
BART6、干扰LOC533103能抑制癌细胞中应力纤维的完整性。
细胞肌动蛋白骨架是伪足的必要组成，与肿瘤的转移息息相关。应力纤维(stress fiber)是真核细胞中广泛存在的微丝束结构。电镜观察表明，应力纤维由大量平行排列的微丝组成，其成分为肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和α-辅肌动蛋白，其组织形式与肌原纤维相似，在细胞质中具有收缩功能。应力纤维与细胞间或细胞与基质表面的附着有密切关系。应力纤维可能在细胞形态发生、细胞分化和组织的形成等方面具有重要作用。
本文主角是两个分子，依旧按照套路来做。先筛miRNA，验证功能，找作用lncRNA以及靶蛋白，验证lncRNA功能。就这样一篇5分的文章，总体来说缺少了很多内容。比如BRAT6、LOC53103、EMT MARKER之间的调控关系并没有解释清楚。
这篇文章整体来说思路是EBV microRNA BRAT6 通过下调lncRNA LOC53103抑制鼻咽癌的EMT和转移，文章是围绕病毒microRNA BRAT6展开的，在对microRNA靶基因进行选择的时候，先是发现两个编码基因TUSC2、VANGL2不能被BRAT6调控，然后才选了lncRNA LOC53103作为靶分子。那么，问题就来了：lncRNA LOC53103是不是一个好的靶分子呢？
小张认为选的不太好，因为lncRNA LOC53103是一个新分子，这说明lncRNA LOC53103与EMT、与肿瘤的关系尚不明确，意味着作者要分精力研究lncRNA LOC53103的功能。在这篇文章中，作者通过细胞与动物实验证明lncRNA LOC53103的功能，但是也仅限于此。那么这篇文章可以如何调整呢？
其实作者可以把思路调整下：先做lncRNA LOC53103的功能，即研究lncRNA LOC53103与鼻咽癌EMT的关系， 这里需要解决LOC53103通过怎样的分子机制影响EMT过程，并把这项研究单独成文发表一篇文章，这篇文章的核心分子就是 LOC53103，把各项工作做好发篇5分的文章应该问题不大；然后再做microRNA BRAT6 的研究，这时直接引用前面的这篇文章，重点是BRAT6 的功能以及BRAT6 对LOC53103的调控。
另外，对于申请基金来说，则可以把第一篇文章作为前期的工作基础，把第二篇文章作为基金的假说。大家可以体会下。
microRNA与lncRNA之间的互相调控是很多文章的研究主题，大家比较熟悉的是ceRNA的调控模式，ceRNA的调控模式有两个注意点：一个是lncRNA与靶基因之间的正相关调控关系，与microRNA的负相关关系，另外一个是三者的丰度比例；而这篇文章说的是lncRNA作为microRNA的下游靶基因分子，与ceRNA是不同的机制。
That's all. Thank you!
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