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最近，很多人开始迷恋外泌体了，但外泌体主要研究啥，可能还有很多人不了解？
外泌体，英文名叫Exosomes，是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30-150nm的具有脂质双层膜的微小膜泡，包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。它携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。2013年，发现细胞囊泡运输的调节机制的科学家们，荣获了当年诺贝尔生理学或医学奖。
图一：细胞释放外泌体
几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体，同时外泌体也广泛存在于体液中，包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水等（图二）。外泌体的表面标记主要有 CD63、CD81、CD9、TSG101、HSP27 等。外泌体富含胆固醇、鞘磷脂、蛋白和核酸（如DNA、lncRNA、tRNA、mRNA、microRNA）等。
图二：外泌体也广泛存在于体液中
外泌体内含有大量蛋白质、脂质、DNA、RNA，可调节多种生理或病理反应，包括有血管生长、肿瘤细胞侵袭与转移、免疫应答等。2007年， Valadi等发现鼠的肥大细胞分泌的外泌体可以被人的肥大细胞捕获，并且其携带的mRNA成分可以进入细胞浆中可以被翻译成蛋白质，不仅仅是mRNA，外泌体所转移的microRNA同样具有生物活性，在进入靶细胞后可以靶向调节细胞中mRNA的水平。也就是说外泌体很有可能参与某些调控机制，这一发现极大的激发了大家对它的研究热情（图三）。除mircoRNA外，我们也可以对外泌体中其它RNA进行检测。但外泌体中的mRNA、lncRNA等大分子量RNA，含量较低、数量较少，并且稳定性比mircoRNA差，容易发生降解，检测的稳定性与重复性不如mircoRNA。
图三：外泌体参与许多生理或疾病过程
作为人体内的一类重要囊泡，外泌体已成为科研热点（表一）。截止目前发现了超过41860种蛋白质、2838种microRNA、3408种mRNA。外泌体常用的数据库：（ExoCarta：http://www.exocarta.org/）。
表一：近些年外泌体相关的研究文章发表数量分布
由于研究人员对外泌体的研究热情不断增大，近三年来申请基金的中标数也是逐年增加。
表二：外泌体近三年来的中标数
目前，由于样本来源和性质不同，仍没有很好的方法能既考虑外泌体获得率，又兼顾到其纯度和生物活性。现有的外泌体的提取方法主要包括以下几种：
这是目前外泌体提取最常用的方法。此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。
这种操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性 ，但同样存在纯度不足的问题。
用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。
这种方法可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，但是非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不便进行下一步的实验 。
该方法将PS（磷脂酰丝氨酸）与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS。该方法与免疫磁珠法相似，获得的外泌体形态完整，纯度最高。由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，外泌体可用于细胞共培养和体内注射。
这种方法分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是需要特殊的设备，应用不广泛 。
下面我们向大家介绍一下如何收集样本：
1.细胞上清（最佳样本量在15-20ml及以上）
A. 细胞在正常含有血清的培养基中培养一定时间，贴壁细胞密度在70%-80%，悬浮细胞密度在60%-70%。
B. 对于贴壁细胞，去除原有培养基，换为新的不含外泌体的培养基或者无血清培养基；对于悬浮细胞，300×g，4℃，10分钟收集细胞，使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基悬浮细胞并继续培养。
C. 细胞继续培养24-48小时，根据细胞的生长速度确定收取上清时间。
D. 收集细胞上清，300×g，4℃，离心10分钟；小心吸取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片。3000×g，4℃，再次离心15分钟，确保将细胞或者细胞碎片去除干净。
E. 取上清，这里很重要的是：一定要注意避免吸入细胞或者细胞碎片，合并相同的细胞培液上清样品，装入无菌的玻璃瓶，可在4℃短期保存（1-2天），长期保存可冻存于-80℃。建议细胞上清分离后尽快进行外泌体分离，保存在4℃和-80℃都会对产量有一定的影响。
2.血浆样品（最佳送样量4ml，需要全血约8-10ml）
A. 用采血针和抗凝管（含EDTA）抽取全血，轻柔混匀后于室温或4℃保存。最好在1小时内进行下一步处理。这里一定要注意是收集血浆样本用于操作RNA一定不要用肝素抗凝管，因为肝素会影响后续的酶反应。
B. 4℃条件下，1900×g离心10分钟，小心取上清即为血浆，最后500μL左右丢弃。得到的血浆再次离心，条件为4℃，3000×g，15min，小心吸出血浆，注意不要碰到底部和侧面的沉淀物。
C. 将血浆冻存于-80℃。
D. 干冰寄送样本。
3.血清样品 (最佳送样量4ml，需要全血约8-10ml)
血清是血液凝固析出的淡黄色透明液体。
A. 轻轻将全血滴入洁净的离心管或用采血管采血（注意收集血清样本一定不要加入抗凝剂）。
B. 室温静置30分钟，4℃条件下，静置3~4小时，可见血块析出（也可放置 4℃冰箱过夜）。
C. 4℃条件下，1900×g离心10分钟，可见淡黄色血清，取出上清后可再4℃条件下，3000×g离心10分钟，最大程度保证血清质量。
D. 将血清冻存于-80℃。
E. 干冰寄送样本。
注意事项：
A. 用于分离外泌体的样品不能加入任何RNA保护剂（如Trizol）。
B. 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。
C. 冻存过的血浆和血清样本可以用于分离外泌体，并进行电镜观察。
D.准备分选外泌体的样本的预处理十分重要，必须保证有效去除所有细胞碎片及其它不需要的膜结构。因此要求全血不可冻融，取血后尽早制备血浆或血清，血浆或血清可以放-80℃保存，但应避免反复冻融。
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