RT-PCR技术相关曲线解读

生信草堂交流群

加入模式：加微信bioinformatics88为好友，备注“加入生信草堂交流群”，在群里注明姓名、单位、研究领域。

征稿邮箱：[e-mail]

详情阅览：一手科研开花，一手赚钱零花

freescience联盟 

由高校、医院FS公众号和科研技能公众号等百家单位联合创建的科研交流分享平台；联盟的宗旨：“公正至上，自由分享，平等共赢”。欢迎您的关注，让我们共同学习进步。戳这里Freescience联盟公众号原文，请多关注哦~

上期为大家介绍了 Real time PCR的操作步骤 ，不知道小伙伴们是否有所收获呢？今天将进一步为大家解读RT-PCR技术中的一些曲线，希望大家对此有更深入的认识。

RT-PCR技术中主要的曲线有下面三种：

1. 扩增曲线

随着实验的进行，扩增产物不断累积，相应的荧光信号也不断在增加，每进行一个循环就采集一次荧光的信号，经过一定的循环数后（比如40个循环），就可以得到下面的扩增曲线图（横坐标代表扩增的循环数cycle，纵坐标代表荧光的强度）。

这其中还需要弄清楚一些基本概念，如：

基线：指在PCR扩增反应的最初的几个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，该直线叫做基线。这个了解即可，对实验操作没什么影响。

阈值线：一般来说，前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，阈值的设定就是3-15个循环荧光信号标准差的10倍，在PCR扩增的指数期（如图中箭头所指）。

说的这么严肃，其实很多仪器自动设定的阈值线基本能够满足我们的实验要求，不需要我们手动设置的。

CT值：我们常会用CT值来计算我们的相对含量，即扩增产物的荧光信号到达设定的阈值线时所经历的扩增的循环数，也就是图中扩增曲线和阈值线的交汇处的横坐标所显示的值。

2. 标准曲线

做标准曲线有啥用？标准曲线可以用来确定未知的样品的初始量。如果是需要绝对定量，是必须要有标准曲线的。

怎么做呢？每个模板的CT值与该模板的起始的拷贝数的对数是存在线性关系的，起始的拷贝数越大，CT值就越小。标准品按照一定的倍数稀释5-6个浓度左右，根据RT-PCR的反应条件进行反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，CT值为纵坐标，绘制线性曲线。而未知样品的拷贝数即可根据曲线方程计算得来。

那么，问题来了，这个标准曲线的标准品怎么确定呢？

（1）如果是做绝对定量，标准品的要求比较高，这个的制备过程也相对复杂一些，但结果也更加精确。

要求：

必须是准确定量的、标准化的、稳定的质粒DNA（也可以是基因组DNA，纯化后的PCR产物等），

5-6个稀释梯度；

PCR反应仪器要同一种，并且同时操作；

反应的条件一致：反应体系、参数等等；

反正能一致的都一致就对了。

（2）如果只是想看看扩增效率（E）（E=10-1/斜率），检验PCR的反应体系是否符合要求，我们有时候也采用待测试样品作为标准品，逐步稀释后进行反应，最终看标准曲线的斜率和R²是否符合要求，我比较懒，常会用这种方法，不过有些发文章的要求会比较高，那还是要乖乖去做的。

3. 溶解曲线

简单点说，就是考察染料标记法结果的特异性的。再简单点，就是分分钟确定你的引物是否有效。

复杂的原理我就不解释了，关键是怎么看和怎么判断。如果反应产物单一，曲线会出现一个尖峰；如果有二聚体或者非特异性的扩增，就会出现至少两个峰或者更糟糕。采用SYBR Green染料时是必须要做溶解曲线的，毕竟这是一个非特异性的染料。

在实验中，大家还是会碰到很多问题的，下面列举几个比较常见的问题：

（1）扩增曲线经过40个循环后没有平台期？或者扩增曲线根本无法呈现指数上升？

这种情况下很有可能是你的起始模板浓度太低了，即便经过40个循环也是达不到平台期的，可以通过增加循环数来验证是否是该问题。

（2）溶解曲线的问题：比如多个峰，或者尖峰的前面有个小小的小峰，或者没有峰？

这个跟引物以及反应的体系温度有关系，如果说没有峰值或者杂乱无章，很有可能是引物的问题，建议重新设计引物。有时候有小的峰，可以通过优化反应条件，比如退火温度的优化来消除这个影响。

# 篇幅有限，不可能罗列所有问题，大部分都是一些概念上的东西。问题有很多，解决的方法也有很多，关键是对实验中的每个环节都要把关。有时候我们只要通过CT值进行相对定量分析，那么把握好基本的实验操作，对曲线结果有一定的认识，一般不会有大的问题。