流式细胞术检测细胞周期

今天早上看到一则新闻说山东省已经颁发关于保护月经期女性的3条建议，如果诊断痛经或月经过多，可以申请休息。好人性化的规定啊。也不知重庆会不会实行。(果子：这是因为要讲细胞周期让你跳转到了月经周期么？)

昨天是正式工作的第一天，果子老师总是可以帮我解决一些现下的麻烦，总是可以给我一些耳目一新的东西。昨天我们主要谈到了两个主题，一个是关于转染问题。一个是关于上次他看的文献，有关不用抗体就可以做WB的文章，这也是刷新我的认知啊。但是我对CRISPER-Cas9的认识还不够，所以决定这一周，最迟下一周要把这个东西搞明白。我已经决定课题组内下周文献分享就分享果子老师推荐的那篇文献，希望我也有所得到，到时和大家分享。

在分享今天的内容之前，先跟大家聊聊有关preprint的一个事。相信很多人也是第一次听到preprint这个词。以下来自于维基百科的解释：预印本（Preprint）也称未定稿本。在学术出版领域，预印本是指尚未在需要同行评审的科学期刊上出版的科学文献的草稿。

作者在写作完成后，便可将草稿预先公开让大家阅读并提出更改建议，在更改后可以提交相应学术期刊进行出版。
这个东西有好也有坏（以下言论均是我的理解，以供参考） 。

• 好处就是，在你的文章投递一些杂志后，总是不能送外审，总是被拒，那你可以选择preprint，这样只要有做相关领域的人均可搜索到你的文章进行阅读，并给你意见进行修改，你可以和那些人讨论，一起修改。总之还可以。这样也可以避免恶意审稿，以及知识产权、专利的问题。

• 当然缺点也很多，并不是所有杂志均接收preprint的文章，所以你在选择preprint之前要看自己心仪的杂志是否接收这种形式，比如science就不接收预印本的文章。另外就是害怕你把你的创新性的发现post出来，会有人跟着你这个做，并且超越你的进度。

上周刚递了一篇preprint。

好了，今天我主要分享细胞周期的检测方法。

细胞周期(我记得这个名词解释在高中生物时是必考的)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。如下图：

细胞周期.png

• G0期：这一期的细胞称为休眠细胞，暂时脱离细胞周期,不进行DNA复制和分裂。但这些细胞可在某些条件的诱导下重新开始DNA合成, 进行细胞分裂。

• G1 期：主要合成RNA、核糖体、蛋白质、脂类和碳水化合物。

• S期：这个时期主要合成DNA, 同时还会合成组蛋白, DNA复制所需的酶都在这一时期合成。

• G2期：这一时期是DNA合成后期。主要大量合成ATP、RNA、蛋白质, 包括微丝微管蛋白。

• M期：这个时候RNA合成停止, 蛋白质合成减少, 以及染色体高度螺旋化。

其实高中生物还是挺有用的，你了解清楚每个时期主要合成的是什么，

• 在做电镜时你就可以认出你的细胞处于什么时期，

• 以及在做药物实验时，为什么要饥饿细胞24小时。

在我们做的一个负链RNA病毒感染的细胞模型中，大部分感染细胞的细胞周期都停留在G0/G1期，这就是因为它是一个RNA病毒，在感染早期得先抑制宿主的转录水平，然后促进自己的负链变为正链RNA，进行翻译。

当然这些过程有可能没有严格的先后顺序，同时进行。它为什么会让细胞停留在G0/G1期呢，还有主要是病毒的哪个蛋白发挥了这些作用呢，调控了宿主细胞的哪个周期蛋白或者酶呢，这些都是我要问的问题及接下来的实验设计。

下面开始分享流式细胞术检测PI染色细胞的方法。

细胞周期检测可以自己购买碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），自己染色，也可以买现成的试剂盒。

先分享自己配置的PI，流式细胞术检测。

PI染色的原理：

在不进行细胞通透时，PI不能进入有完整细胞膜的细胞也就是正常细胞和凋亡细胞。而坏死的细胞或者处于焦亡状态下的细胞，由于细胞膜完整性遭到破坏，所以PI可进入细胞内与DNA结合，所以PI可以鉴别坏死、焦亡细胞。

做细胞周期的原理就是，根据细胞周期各个时相的DNA 含量不同（也就是我们高中学的在不同时期DNA是几个N那个东东）。通常正常细胞的G0/ G1 期具有二倍体细胞的DNA含量（2N），G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量（4N） ,而S期的DNA 含量介于2N和4N之间。细胞75%冰乙醇固定通透后PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此，可以用流式细胞内DNA含量进行检测时，便可将细胞周期区分为G1/G0 期，S 期和G2/M 期,这样可以得出各个时期细胞百分数。

下面是自己配置PI染色。可以自己配置，用1XPBS配置，储存浓度为1 mg/mL。

PI

也可单独购买BioRAD配置好的PI溶液。
PI（Bio-RAD，ReadiDrop ）

PI.png

所有的液体均需要四度预冷，所有离心均为800rpm，2-5min。

• 1.悬浮细胞直接离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞2-3次（贴壁细胞，弃上清后，常规消化后，离心弃上清后，用预冷PBS洗细胞2-3次）。

• 2.加入预冷70%乙醇，室温固定1h或者4℃固定过夜，再或-20℃长期固定（最长做过-20℃固定了45天）。个人建议最好尽快检测。如果取多个时间点，可以每个时间取回来后-20℃固定等最后一次固定完了一块测。

• 3.细胞染色
  离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞2次。加入500uL浓度适宜的PI（一般为10-20ug/mL每1万个细胞）（稀释用冰PBS），现加100ug/mL RNase A， 0.2% Triton X-100。 4℃或者避光孵育30-50min或者室温20min 。
  弃上清后，以1mL的PBS洗细胞2次后，用500uLPBS混匀细胞，待流式检测。

• 4.流式分析