·临床实验研究·
任静1，2，李刚1，门剑龙2
(1.天津大学天津市生物医学检测技术与仪器重点实验室，天津 300072；2.天津医科大学总医院精准医学中心，天津 300052)
摘要：目的 评价肝素诱导的血小板减少症(HIT)抗体试验的诊断性能。方法 收集2014年9月至2016年11月HIT患者血浆标本52例，未发生HIT的用肝素治疗患者的血浆标本126例和体检健康者血浆标本50例。根据是否伴有血栓形成，将HIT患者进一步分为未伴血栓形成的孤立性HIT组30例和伴血栓形成的HIT(HITT)组22例。用ACL-TOP 700型血液凝固仪及其相关试剂(HemosIL HIT-AbPF4-H)测定血浆HIT混合抗体；用ACL AcuStar发光分析仪及其相关试剂(HemosIL AcuStar HIT-IgGPF4-H)测定血浆IgG特异性抗体。结果 肝素对照患者组的混合抗体和IgG特异性抗体水平高于健康人对照组，差异有统计学意义(U值分别为1 644.0、1 191.0，P均<>U值分别为550.0和4.7，P均<0.01)。roc曲线结果显示，混合抗体和igg特异性抗体诊断hit的敏感性均为100%，上调临界值可提高两个试验的诊断特异性。混合抗体以1.50 u/ml为临界值时，肝素对照患者组的阳性率为27.8%，hit患者组为100%。igg特异性抗体以1.51="" u/ml为临界值时，在肝素对照患者组的阳性率为0，在hit患者中为100%。igg特异性抗体临界值为2.32="" u/ml时，评估hit患者血栓形成风险的诊断敏感性为90.9%，特异性为80.0%；高于此临界值的hit患者在15="" d内的血栓形成累积概率显著增加(log-rank="">χ2=56.577，P<>结论 HIT混合抗体试验与IgG特异性抗体试验有助于对HIT患者进行排除诊断、诊断或风险评估。
关键词：肝素诱导的血小板减少症；验前概率评分；HIT抗体；IgG特异性抗体；血栓形成
肝素诱导的血小板减少症(heparin induced thrombocytopenia，HIT)是一种由抗体介导的不良反应，临床表现为血小板计数降低，患者可能发展为静、动脉血栓，严重者危及生命。在住院患者中，各种原因所致的血小板减少症和肝素暴露普遍存在，疑似HIT患者显著多于确诊患者。因此，如何准确识别并及时治疗HIT是临床医生面临的重要挑战。目前，利用验前概率评分对疑似HIT患者进行初筛，并通过实验室检测对中、高临床可能性患者进行排除诊断或诊断已成为经典流程[1-2]。近年来，普通实验室主流的HIT检查方法是HIT抗体(抗PF4-肝素抗体)检测，包括混合抗体试验(主要为IgG，有少量的IgA和IgM)和IgG特异性抗体检测[3]。我国由于对HIT的认识起步较晚，尚缺乏中国人群HIT抗体诊断性能的数据。本研究对近2年内收集的52例经临床确诊并治疗的HIT患者和126例应用肝素的非HIT患者资料进行回顾性分析，观察混合抗体和IgG特异性抗体的水平和诊断性能，为建立HIT规范化诊疗流程提供依据。
1.1 研究对象 2014年9月至2016年11月天津医科大学总医院HIT患者52例，男23例，女29例，年龄(60.1±8.4)岁，其中血管外科18例，呼吸科11例，心脏外科冠状动脉搭桥手术23例；根据是否伴有血栓形成，将患者进一步分为未伴血栓形成的孤立性HIT组30例和伴血栓形成的HIT(heparin-induced thrombocytopenia with thrombosis，HITT)组22例。
血管外科和呼吸科患者HIT的诊断：须符合验前概率评分[1-2]，评分为中、高度临床可能性(见表1)，HIT混合抗体试验阳性，替代抗凝治疗后血小板计数恢复正常。心脏外科患者HIT的诊断：须符合血小板计数降至基线值的50%或更低，伴有血栓事件发生或(和)手术后5～14 d(心脏外科手术当天为0 d)，且HIT混合抗体试验阳性，替代抗凝治疗后血小板计数恢复正常。上述患者在临床会诊后均给予替代抗凝治疗(比伐芦定或阿加曲班)；治疗后均未发生血栓栓塞和出血，亦未出现明显的血流动力学异常和肾脏损害，出院时血小板计数恢复且临床表现明显改善。肝素对照患者组，同期天津医科大学总医院住院的未发生HIT的用肝素治疗的患者126例，男71例，女55例，年龄(62.7±9.5)岁，患者来源科室及诊断与HIT患者按比例匹配。凝血试验异常、血小板缺陷性疾病、自身免疫病、感染及急、慢性肝病患者均予以排除。健康人对照组50例，男27例，女23例，年龄(35.4±10.7)岁，均为体检健康者。
表1 HIT验前概率评分的赋值标准
依据2分1分0分血小板减少的数量特征PLT减少50%以上且最低值PLT减少30%～50%或最低值PLT减少不超过30%或最低值≥20×109/L处于(10～19)×109/L<10×109><>
注：肝素接触首日为第0天，PLT开始减少时间即为血小板减少症发生的时间；临床可能性：低度,≤3分;中度,4～5分;高度,6～8分。
1.2 标本采集与处理 于使用肝素后第5～10天采集患者静脉血标本，枸橼酸钠抗凝，2 664×g离心15 min，取上层乏血小板血浆，采集后6 h内测定HIT抗体。
1.3 指标检测 用ACL-TOP 700型血液凝固仪及其相关试剂(HemosIL HIT-AbPF4-H)以定量微粒凝集法测定血浆HIT混合抗体(IgG、IgA和IgM)；用ACL AcuStar分析仪及其相关试剂(HemosIL AcuStar HIT-IgGPF4-H)以化学发光法测定血浆IgG特异性抗体。
1.4 统计学分析 用SPSS 17.0统计软件进行。混合抗体和IgG特异性抗体数据以M(P25，P75)表示，两组间比较用Mann-Whitney U检验，用ROC曲线评价两种HIT抗体的诊断性能，用Kaplan-Meier曲线进行生存分析；P<>
2.1 肝素暴露患者的HIT抗体检测结果 见表2。肝素对照患者组混合抗体和IgG特异性抗体水平均高于健康人对照组，差异均有统计学意义(U值分别为1 644.0、1 191.0，P均<>U值分别为550.0和4.7，P均<>
表2 健康人和肝素暴露患者HIT抗体检测结果
分组n混合抗体(U/mL)IgG特异性抗体(U/mL)健康人对照组500.32(0,0.67)0.11(0.03,0.58)肝素对照患者组1260.67(0,7.49)0.14(0.08,1.40)HIT组523.55(1.84,5.06)2.29(1.62,3.58)
2.2 两种HIT抗体试验诊断HIT的ROC曲线 ROC曲线结果显示，当混合抗体和IgG特异性抗体的临界值分别为1.05 U/mL和1.02 U/mL时，诊断HIT的敏感性均为100%，特异性分别为73.8%和96.8%；上调临界值分别至1.50 U/mL和1.51 U/mL，特异性分别为82.5%和100%,敏感性为100%。
2.3 患者组中混合抗体和IgG特异性抗体的阳性率 见表3。健康人对照组混合抗体和IgG特异性抗体均为阴性。混合抗体以1.50 U/mL为临界值时，肝素对照患者组的阳性率为27.8%(35/126)，HIT患者组为100%(52/52)。
IgG特异性抗体以1.02 U/mL为临界值时，肝素对照患者组阳性率为3.2%(4/126)，HIT患者组为100%(52/52)；以1.51 U/mL为临界值时，肝素对照患者组阳性率为0，HIT患者为100%(52/52)。
表3 健康人和肝素暴露患者HIT抗体的阳性率(%)
分组混合抗体临界值1.50U/mLIgG特异性抗体临界值1.02U/mL1.51U/mL健康人对照组(n=50)000肝素对照患者组(n=126)27.8(35/126)3.2(4/126)0HIT组(n=52)100(52/52)100(52/52)100(52/52)
2.4 孤立性HIT组和HITT组2种HIT抗体血浆浓度结果 见表4。孤立性HIT组混合抗体水平与HITT组差异无统计学意义(U=291.5，P>0.05)；HITT组IgG特异性抗体水平高于孤立性HIT组，差异有统计学意义(U=94.0，P<>
表4 HIT患者两种HIT抗体检测结果
分组混合抗体(U/mL)IgG特异性抗体(U/mL)孤立性HIT组(n=30)3.54(1.84,5.05)2.04(1.62,3.46)HITT组(n=22)3.65(1.89,5.02)2.60(2.26,3.58)*
注：*，与孤立性HIT患者组比较，P<>
2.5 IgG特异性抗体评估HIT患者血栓形成的ROC曲线 ROC曲线下面积为0.858(95%CI：0.746～0.969)。IgG特异性抗体临界值为2.32 U/mL时，评估HIT患者血栓形成的敏感性为90.9%，特异性为80.0%。
2.6 IgG特异性抗体评估HIT患者血栓形成风险的结果 见图1。以血栓形成为终点事件，IgG特异性抗体以2.32 U/mL为临界值，与低于临界值的HIT患者比较，高于临界值的患者15 d内血栓形成的累积概率增高(Log-rank χ2=56.577，P<>
图1 HIT患者组VTE累积概率
当肝素与血小板首次接触后，血小板释放血小板第4因子(platelet factor 4，PF4)，PF4与肝素结合形成PF4-肝素复合物(PF4-H)并发生构象改变，刺激免疫细胞产生应答，释放抗PF4-H抗体(即HIT抗体，主要类型是IgG，少量为IgM和IgA)。HIT抗体可与PF4-H结合形成更大分子的复合物(IgG-PF4-H)。HIT抗体的致病性主要依赖由IgG型抗体与血小板表面特异性IgG受体(FcγRⅡA)结合并导致血小板持续活化，引发促凝风险[4]。同时血小板栓子可通过HIT抗体与血管内皮细胞表面的硫酸乙酰肝素-游离PF4复合物结合，固定于血管壁形成附壁血栓，血小板计数因消耗而显著降低；另一方面，血小板源性微粒释放[5]以及HIT抗体刺激单核细胞释放组织因子均显著激活凝血途径。
本研究结果显示，在未发生HIT的肝素对照患者组中，HIT混合抗体和IgG特异性抗体水平均高于健康人对照组(P均<>P均<>[6-9]。本研究显示，混合抗体以1.50 U/mL为临界值时，在肝素对照患者中的阳性率为27.8%(与欧洲数据相近)，在HIT患者中为100%，表明HIT混合抗体试验虽有高度敏感性，但特异性不足，用于HIT排除诊断是安全的，但易导致过度诊断。
2012至2016年间，用化学发光法检测IgG特异性抗体的有效性获得了更多证据支持。研究认为，IgG特异性抗体在设定合理临界值的基础上可实现对HIT的有效诊断[8-10]。Nagler等[11]的系统评价和荟萃分析显示，IgG特异性的化学发光法的诊断敏感性>95%，特异性均>90%。Sun等[12]的系统评价和荟萃分析显示，IgG特异性的化学发光法有较高的敏感性和特异性，其诊断特异性优于IgG特异性的ELISA，能进一步提高对疑似患者的诊断准确性，减少误诊和过度治疗。本研究中，用1.02 U/mL作为临界值时(与试剂说明书建议的诊断临界值1.00 U/mL相近)，IgG特异性抗体在HIT患者中的阳性率为100%，但在肝素对照患者组中也有3.2%的阳性率，我们将临界值上调至1.51 U/mL时，HIT患者阳性率仍为100%，肝素对照患者组阳性率为0，表明即使是IgG特异性抗体，临界值设置过低仍有可能导致假阳性，因此需建立适当的临界值以提高诊断特异性，帮助临床确诊。
本研究显示，HITT患者的混合抗体水平与孤立性HIT患者间差异无统计学意义，但IgG特异性抗体水平高于孤立性HIT患者，同时生存分析和ROC曲线显示，血浆IgG特异性抗体水平高于2.32 U/mL时，HIT患者在15 d内的血栓累积风险概率增加，该临界值评估血栓事件的敏感性为90.9%，特异性为80.0%，表明IgG特异性抗体有助于预测HIT患者血栓发生的风险。需注意的是，尽管IgG特异性抗体有较高的诊断性能，在临床使用时仍需与验前概率评分相结合以提高阳性检出率。目前，没有证据显示对应用肝素的患者进行IgG特异性抗体的普筛有助于降低HIT发生的风险。
4 参考文献
[1]Linkins LA, Dans AL, Moores LK,et al. Treatment and prevention of heparin-induced thrombocytopenia: Antithrombotic Therapy and Prevention of Thrombosis, 9th ed: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines[J]. Chest，2012，141(2 Suppl):e495S-e530S.
[2]Watson H, Davidson S, Keeling D. Guidelines on the diagnosis and management of heparin-induced thrombocytopenia: second edition. Haemostasis and Thrombosis Task Force of the British Committee for Standards in Haematology[J]. Br J Haematol, 2012, 159(5):528-540.
[3]Nagler M, Bakchoul T. Clinical and laboratory tests for the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia[J]. Thromb Haemost, 2016, 116(5):823-834.
[4]Rollin J, Pouplard C, Gruel Y. Risk factors for heparin-induced thrombocytopenia: Focus on Fcγ receptors[J]. Thromb Haemost, 2016, 116(5):799-805.
[5]邓新立,丛玉隆,殷宗健,等.不同浓度血小板激活剂激活血小板微粒膜表达PAC-1、CD62p的比较[J].临床检验杂志,2004,22(3):181-183.
[6]Van Hoecke F, Devreese K. Evaluation of two new automated chemiluminescent assays (HemosIL® AcuStar HIT-IgG and HemosIL® AcuStar HIT-Ab) for the detection of heparin-induced antibodies in the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia[J]. Int J Lab Hematol, 2012,34(4):410-416.
[7]Althaus K, Hron G, Strobel U, et al. Evaluation of automated immunoassays in the diagnosis of heparin induced thrombocytopenia[J]. Thromb Res, 2013,131(3):e85-e90.
[8]Minet V, Baudar J, Bailly N, et al. Rapid exclusion of the diagnosis of immune HIT by AcuStar HIT and heparin-induced multiple electrode aggregometry[J]. Thromb Res, 2014,133(6):1074-1078.
[9]Vianello F, Sambado L, Scarparo P, et al. Comparison of three different immunoassays in the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia[J]. Clin Chem Lab Med, 2015,53(2):257-263.
[10]Jourdy Y, Nougier C, Rugeri L, et al. Prospective evaluation of automatized PF4/heparin immunoassays HemosIL HIT-Ab (PF4-H) for the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia[J]. Int J Lab Hematol, 2015,37(2):244-252.
[11]Nagler M, Bachmann LM, Ten Cate H, et al. Diagnostic value of immunoassays for heparin-induced thrombocytopenia: a systematic review and meta-analysis[J].Blood, 2016, 127(5):546-557.
[12]Sun L, Gimotty PA, Lakshmanan S, et al. Diagnostic accuracy of rapid immunoassays for heparin-induced thrombocytopenia. A systematic review and meta-analysis[J]. Thromb Haemost,2016,115(5):1044-1055.
REN Jing1，2，LI Gang1，MEN Jian-long2
(1. Key Laboratory of Biomedical Detection & Instruments of Tianjin City, Tianjin University, Tianjin 300072；2. Precision Medicine Center, Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052, China)
Abstract：Objective To assess the antibody test for the diagnosis performance of heparin induced thrombocytopenia(HIT). Methods 52 plasma samples of patients with HIT， 126 plasma samples of heparin treated patients without HIT and 50 plasma samples of healthy individuals were collected from 2014 September to 2016 November. According to thrombosis, the patients were further divided into two groups: isolated HIT group without thrombosis (30 cases) and heparin induced thrombocytopenia with thrombosis (HITT) group (22 cases). The whole HIT antibody in plasma was assayed by using ACL-TOP 700 coagulation analyzer and reagent (HemosIL HIT-AbPF4-H). The IgG-specific HIT antibody in plasma was assayed by using ACL AcuStar chemiluminescent analyzer and reagent (HemosIL AcuStar HIT-IgGPF4-H). Results The levels of whole antibody and IgG-specific antibody in the patients of heparin control group was higher than those in healthy control (U value was 1 644.0 and 1 911.0, respectively, P<0.01). the="" levels="" of="" two="" hit="" antibodies="" in="" hit="" patients="" group="" were="" higher="" than="" those="" in="" the="" patients="" of="" heparin="" control="" group="">U value was 550.0 and 4.7, respectively, P<0.01). roc="" curve="" showed="" that="" the="" sensitivities="" of="" both="" whole="" antibody="" and="" igg-specific="" antibody="" were="" 100%,="" and="" up-regulating="" the="" cut-off="" value="" could="" improve="" the="" specificity="" of="" both="" tests.="" the="" positive="" incidence="" of="" the="" whole="" antibody="" was="" 27.8%="" in="" the="" heparin="" control="" group="" and="" 100%="" in="" hit="" patients="" group="" while="" the="" cut-off="" value="" was="" 1.50="" u/ml.="" the="" positive="" incidence="" of="" igg-specific="" antibody="" was="" 0="" in="" the="" heparin="" control="" group="" and="" 100%="" in="" the="" hit="" patients="" group="" while="" the="" cut-off="" value="" was="" 1.51="" u/ml.="" while="" the="" cut-off="" value="" of="" igg-specific="" antibody="" was="" 2.32="" u/ml,="" the="" diagnosis="" sensitivity="" of="" thrombosis="" assessment="" was="" 90.9%="" and="" the="" specificity="" was="" 80.0%.="" in="" case="" the="" cut-off="" value="" exceeded="" 2.32="" u/ml,="" the="" accumulating="" risk="" of="" hit="" increased="" significantly="" in="" hit="" patients="" within="" 15="" days="" (log-rank="">χ2=56.577, P<0.01).>Conclusion The whole antibody and IgG-specific antibody could contribute to excluding diagnosis, diagnosis or risk assessment for the suspected HIT patients.
Key words：heparin-induced thrombocytopenia；pre-test probability scores； HIT antibody；IgG-specific antibody；thrombosis
DOI:10.13602/j.cnki.jcls.2017.12.11
基金项目：天津市科技计划项目(16KPXMSF00170)。
作者简介：任静，1978年生，女，副主任技师，博士，主要从事血栓性疾病的实验室诊断研究。
通信作者：门剑龙，主任技师，博士，E-mail：thromhaemo@126.com。
中图分类号:R446.11
文献标志码:A
(收稿日期：2017-07-05)
(本文编辑：王海燕)
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