血友病因子检测，MDA来帮忙

什么是血友病？

止血过程是一个凝固和出血间的生物学的平衡过程。其凝固过程中的任一凝血因子的缺乏都将使凝血平衡倾向于出血趋势。血友病是一种由于FVIII或FIX缺乏的性染色体遗传性出血紊乱，分别称为血友病A和血友病B。FVIII和FIX因子基因位于X染色体上，意味着基本上是男性受累及。而女性由于有两个X染色体，即使一个基因缺失，另外一个正常染色体也可以提供足够的因子活性而维持无出血症状。遗传性的血友症的类型可见下图1表示。血友病的发病率没有种族或地区差异。在男性人群中，血友病A的发病率约为1/5 000，血友病B的发病率约为1/25 000。所有血友病患者中，血友病A 占80%~85%，血友病B 占15%~20%【1】。然而，多达三分之一的血友病没有家族史和自然突变缺失导致【2】。

血友病的主要的临床症状是反复出血。出血的严重性直接与血浆中相应因子水平缺乏的程度相关。例如，病人如果是存在越低水平的FVIII可有越严重的出血趋势和严重的临床症状。严重的血友病患者更易出血同时并发症越严重。相反地，轻度的血友病将经历更少的出血伴或不伴并发症。中等程度的血友病呈现中等临床症状。【3-5】。

如何进行血友病的实验室诊断？

目前实验室检测指标涉及PLT计数，常规出血筛查，以及VIII或IX等相应血友病因子检测，以及抑制物的检查和基因检测等。

当APTT延长时，用正常混合血浆和病人血浆等比例混合进行纠正实验。用于确定延长的APTT是由于因子缺乏或由于抑制物如肝素等。如果此病人仅仅为因子缺乏加入的正常血浆的因子可以补充病人血浆中缺乏的因子因而可以纠正APTT的值至正常范围。而如果是因子抑制物存在则不会纠正检测结果。

实验室如何进行血友病检测和治疗后监测？

以血友病A检测为例说明，检测方法：

使用试剂

■APTT试剂

■标准人类血浆，用于制作定标曲线以检测FVIII

■乏FVIII因子血浆—所有因子均含有，唯独缺少FVIII

■正常和异常质控

检测仪器：

单个凝血因子检测可以在SYSMEX的CS系列及CA系列凝血分析仪上操作。当试剂批号改变时需要使用标准人类血浆进行校准。详细操作请联系希森美康的当地售后服务人员。

病例1：男，42岁，入院，出血原因待查。检测APTT，开始发现报警slow reaction, APTT不出值，APTT在50%凝固点处的秒值延长115.8秒。使用APTT纠正实验，即刻反应的时间变为47.8秒明显缩短。如下图3和图4。病人FVIII活性检测显示明显降低，最终确诊为血友病A。

实验室检测结果解释

FVIII结果以百分比进行报告。正常参考范围较宽（50%--150%），但此范围与血友病的诊断无关。根据血友病诊断与治疗中国专家共识（2017年版）, 如表格下图5所示，仅有男性患者在FVIII活性低于40% （此处%等同于IU/dl）才会诊断血友病【1】。因子的水平决定着临床上评估其严重程度和其采取治疗方法。

实验室检测结果解释

FVIII结果以百分比进行报告。正常参考范围较宽（50%--150%），但此范围与血友病的诊断无关。根据血友病诊断与治疗中国专家共识（2017年版）, 如表格下图5所示，仅有男性患者在FVIII活性低于40% 才会诊断血友病【5】。因子的水平决定着临床上评估其严重程度和其采取治疗方法。

根据CLSI指南 H48-A和WHO指南，当检测因子活性时，至少检测三个稀释比例的待测样本，至少其中一个落在定标点范围内和一个点落在定标曲线的平行线上。CS系列仪器提供了多点稀释功能即MDA功能可很容易帮助客户实现此检测。

什么是MDA检测功能

CS系列具有的MDA检测功能可以对凝血因子缺乏的检测进行多点稀释后，与其相应因子的平移的标准曲线进行比较，通过比较其曲线的图形来判断是否为抑制物存在或相应因子缺乏，及存在或缺乏的程度。

如下为系列的因子缺乏程度的MDA曲线如下图7，可看出，当活性小于10%，可看出MDA曲线与平行的标准曲线有了偏移夹角。特别在5%以下时，明显看出夹角偏移的程度。

关于因子抑制剂

一个有关血友病治疗相关合并症是产生FVIII的抑制剂（抗体）。这种情况在严重血友病患者（<>）或完成FVIII缺失的患者中更易发生。由于病人实际无内生FVIII，输入的FVIII认为是外来物质受到机体的免疫抵抗而产生抗体。这些抗体作为抑制剂结合输入的FVIII而阻止其参与凝固反应。这意味着更加大量输入因子以维持凝固反应。严重血友病A中约有5%-10%中存在此种反应。而严重的血友病B患者中约有2%-4%存在此种反应。

FVIII抑制剂一般根据其反应动力学特性分为两种类型。I型显示一级反应学特性，与时间和浓度相关。II型非一级反应学特性。

FVIII抑制剂有两个特性，时间依赖性和温度依赖性。所以当含抑制剂病人血浆与正常血浆混合一起时，抑制剂需要孵育一些时间让其逐渐中和FVIII。如果FVIII的活性和孵育时间确定，那么抑制剂的活性也能确定。FVIII检测是使用一系列已知FVIII浓度的病人样本进行稀释检测得到。而系列稀释的样本残留的FVIII水平接近50%的样本可用于计算抑制物浓度，以Bethesda单位报告。一个Bethesda单位是相当于37℃孵育2小时可以灭活50%的FVIII的抑制剂单位。抑制物活性可以使用残留FVIII活性表格（上图6）进行读取。而使用MDA稀释功能可以看到与平衡的标准曲线夹角，并且方向不一致（上图8）。

再来看一个病例，男，37岁，入院检测FVIII，FIX，FXI，FXII，结果分别为*.*, 12.3%,16.2%. 48.5%. 查存在高浓度FVIII抑制剂，浓度为1331.2 B.U，影响了相应的FVIII，FIX，FXI等因子的检测

上图右（图10）FVIII检测MDA可看出明显的因子抑制结果并提示不可信。上图左（图9）红框内两个MDA曲线可以看出FIX，FXI活性在MDA稀释检测受到的明显抑制。

综上所述，常规APTT筛查，以及临床症状表现，以及APTT纠正实验证实可能存在血友病时，要进行FVIII和FIX的活性检测，和相应的抑制物检测，以及CS系列特有MDA多点稀释功能，可以辅助快速查找病因和诊断血友病。

 

参考文献

1. 中华医学会血液学分会血栓与止血学组、中国血友病协作组血友病诊断与治疗中国专家共识（2017年版）.中华血液学杂志2016年5月第37卷第5期ChinJ Hematol，May2016，Vol. 37，No. 5

2. Elisabetta Sacchi et al. Carrier detection andprenatal diagnosis of hemophilia A. 5-years experience at a hemophilia center .lnt J Clin Lab Res 21:310-313, 1992

3. Vincenzo Toschi et al. Diagnosis, laboratoryaspects and management of acquired hemophilia A. Intern Emerg Med (2010)5:325–333

4. J.Teruya (ed.), Management of Bleeding Patients.Springer International Publishing Switzerland 2016.

5. Roger W. Byard MBBS. The changing face of the‘royal disease’ e Medicolegal aspects. Journal of Forensic and Legal Medicine20 (2013) 392-394.

（感谢关注！）