慢病毒用户使用手册

  1.慢病毒概述  

慢病毒（Lentivirus）是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它可以感染分裂细胞和非分裂细胞，可有效地感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞。此外，慢病毒具有嗜核性，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而可以在体内较长期表达。慢病毒的多种优点，使它成为基因传递的强大而有效的工具，获得了广泛的应用。

  2.慢病毒安全操作规范  

锐赛生物提供的是第三代的慢病毒载体系统，包括1个慢病毒表达载体和3个包装辅助质粒，大大降低了发生同源重组的概率，降低了产生复制能力病毒的可能性。同时，本系统的慢病毒颗粒是自身失活型（SIV）病毒，即病毒感染靶细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，从而提高了安全性。

尽管如此，该病毒仍然具有潜在的生物学危险，因此建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假病毒进行生物学实验。此外，建议将本系统生产的慢病毒视为二级生物安全水平的生物，使用时请参照如下基础规范进行实验：

1.在进入实验室工作时，穿着实验服或隔离服，戴上手套和口罩。

2.操作病毒时请尽量使用生物安全柜，小心不要产生气雾或液体飞溅。

3.如果使用普通超净工作台操作病毒，请在打开含有病毒的容器盖子前关闭超净台的风机（由于超净台风向外排，有可能将病毒吹向操作者），并尽快操作；尽量缩短开盖后的病毒在关闭了排风机的超净台中停留的时间，封闭所有含有病毒的容器、耗材、废液后，再打开超净台风机。

4.如果操作时台面有病毒污染，请立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡过夜后弃去。

5.如需离心，应使用密封性好的离心管，或用封口膜封口后离心。

6.实验结束，脱掉手套前先消毒再摘除手套，随后用肥皂洗手。

详细操作规范请参阅卫生部发布的《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS233-2002）、美国疾病控制中心出版的《微生物和生物医学实验室生物安全（第五版）》和世界卫生组织出版的《WHO生物安全手册》。

  3.慢病毒的储存与稀释  

1.病毒长期储存于-80℃冰箱，-20℃保存不要超过1周，4℃保存不要超过3天。

2.病毒的运输采用干冰，收到病毒液后若几天内用于实验，可于4℃保存（于3天内用完）。若短时间内不用，收到病毒后应立即放入-80℃冰箱进行长期保存。病毒使用过程中要避免反复冻融，否则会降低病毒滴度。

3.一般病毒可在-80℃存放1年，但存放时间超过6个月后使用，需重新检测病毒滴度。

4.需要稀释病毒时，将病毒从-80℃冰箱中取出，置于冰上溶解，然后用PBS或培养基（不含血清）稀释到所需浓度后轻柔混匀，尽快使用。

  4.慢病毒感染靶细胞  

A.什么是MOI？

MOI是multiplicity of infection的缩写，中文为感染复数或复感染指数，其含义是感染时病毒与细胞数量的比值，即平均感染每个细胞病毒活性单位数（TU number/cell）。在试验中要求某种细胞感染效率达到80%时的MOI值为佳。

MOI与整合事件及目的基因的表达相关。在一定范围内，目的基因的表达水平与MOI值呈正相关。MOI取决于多种因素，如细胞种类、细胞状态、目的基因大小等。因此，实验前需先查阅文献，了解慢病毒对靶细胞的亲嗜性、感染效率、MOI范围等，若无文献支持，则需通过预实验摸索合适的MOI值。实际上，由于不同的细胞来源、细胞代数、细胞状态、目的基因等差异因素，实际的MOI也会与文献有差异。所以，在正式实验前进行慢病毒感染靶细胞的最佳MOI及感染条件摸索是很必要的。一般，慢病毒感染某种细胞的感染效率达到80%时的MOI值视为最佳MOI值。

B.怎样进行最佳MOI值摸索？

1.感染前一天，用胰酶消化目的细胞并计数, 调整细胞浓度为5×10 5/ml细胞接种到96孔板，培养基体积为100ul。病毒感染时的细胞汇合度50-70%。

2.MOI值的设置若有文献参考，可以参考值为中心设置梯度覆盖参考值；若无文献参考可按10倍稀释设置为100、10、1，每个梯度3次重复

3.实验开始，准备5个无菌的1.5 mL Ep 管，在每个管中加入45 μL DMEM，吸取5 μL 的1×1012 TCID50/ml的病毒(预先从-80℃取出在冰上融化)加入到第一个管中，轻柔混匀，不要产生泡沫。同样从第一管中吸取5 μL 的病毒到第二个管中，混匀。于是第一个管中的病毒滴度为1×1011TCID50/ml，而第二个管中的滴度为1×1010TCID50/ml，依次类推。

4.如果病毒原液的滴度并不是1×1012 TCID50/ml，则取一部分可以加DMEM稀释成1×1012 TCID50/ml，将剩余分装冻回。

5.将10 μL 三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中，加入的病毒量分别为1×107，1×106，1×105，1×104，而细胞经过生长，此时细胞数目约1×105，所以三个孔的MOI分别为100、10、1。

6.在水平方向轻轻拍打培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板放回培养箱孵育。

7.感染48小时后，观察荧光表达情况，通过荧光率，确认腺病毒感染目的细胞的最佳MOI值，同时对感染难易程度及感染时间作出判断。

8.对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当延长观察时间，中途可以换液，保持细胞的活性。

C.慢病毒感染目的细胞正式实验

1.通过感染预实验，确定细胞接种密度、最佳MOI等条件。正式实验前，调整并保持良好的细胞状态。

2.按实验需要将细胞铺板（qPCR检测用12孔板，WB检测用6孔板或更大面积的培养皿），细胞数以第2天密度约30-50%为宜，37℃ 培养过夜。

3.感染前，从-80℃冰箱取出病毒置于冰上融化，用PBS稀释成所需浓度，用枪吹打均匀。

4.感染前给细胞换液，然后向每孔中均匀滴加稀释好的病毒液，轻轻摇匀，37℃培养过夜。

5.感染后24h，吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养。若病毒对细胞无毒性也可不换液。

6.感染后48-72h观测荧光，拍照记录。

7.根据需要，或收细胞抽提RNA检测目的基因在mRNA水平的表达，或收细胞抽提蛋白检测目的蛋白的表达，或收细胞进行细胞功能检测。

5.慢病毒感染的细胞图片