来源：国际呼吸杂志2020年第12期
作者：陈梨 张丽琴 谢超
皖南医学院弋矶山医院呼吸内科，芜湖 241002
通信作者：张丽琴 Email：lizh333333@aliyun.com
摘要
目前复杂的感染性疾病逐渐增加，如脑膜炎、肺炎、脓毒血症等，精准快速的病原学诊断可以帮助临床医师及时优化抗菌药物的使用，提高治愈率。二代测序技术发展迅速，为临床上感染性疾病的病原学诊断提供了非常有价值的诊断途径。
随着医学的发展，人类发现了越来越多的疑难病例，各种病原体的变异导致了复杂感染性疾病发生率逐渐增加，精准快速的病原学诊断可以帮助临床医师及时优化抗菌药物的使用，从而减少住院时间、提高治愈率、改善预后。目前常用的微生物检测方法有痰涂片、痰培养、血培养、脑脊液、胸腹水化验、PCR等，其中痰标本获取干扰因素较多，培养阳性率较低，检测种类有限，缺乏病原体类型、致病性、耐药信息以及罕见或未知的新发病原体相关信息，容易造成漏诊、误诊。故上述方法已不能有效地满足临床需求。而随着二代测序(next-generation sequencing，NGS)技术的不断成熟和普及，为临床上感染性疾病的病原学诊断提供了一种新的有价值的诊断工具。现将NGS在临床上的部分应用进行综述。
1 NGS
在20世纪70年代，Sanger等分别开发了通过链终止和片段化技术对DNA进行测序的方法，这些方法提供了破译完整基因以及整个基因组的工具，从而改变了生物学。Sanger等开发的第一代测序技术(Sanger测序)测序准确性高、读长较长，在人类基因组计划及其他领域取得重大成就，Sanger技术实现了2004年第一个人类基因组序列的完成[1]。随着科学技术的发展，第一代测序技术已不能满足目前全基因组测序的需求，因此出现了现在的新一代基因测序方法，即NGS技术，又称大规模平行测序或深度测序[2]，包括第二代、第三代和第四代测序技术。目前，具有代表性的第二代测序平台有基因组测序仪、HiSeq 2000和MiSeq、寡聚物连接检测测序(sequencing by oligo ligation detection，SOLID)5500XL、个人化操作基因组测序仪；第三代测序平台有HeliScope遗传分析系统和单分子实时测序技术；第四代测序技术有纳米孔测序技术[3]。代表性的第二代测序平台主要技术核心原理是桥式PCR和荧光可逆终止子的边合成边测序，先构建待测单链DNA文库，形成寡核苷酸桥，进行PCR扩增、变性，切掉dNTP 3′端延长终止基团，继续添加碱基进行测序；SOLID测序技术是基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程中测序，单链DNA文库构建、微乳液PCR扩增以及连接酶测序；纳米孔测序技术为单分子测序，有高通量的GridION和U盘大小MinION测序仪[4]。因DNA分子在电泳驱动下通过纳米微孔组成电路时可引起特征性电流变化，据此可确定DNA分子的碱基类型和排列顺序。其有生物纳米孔和固态纳米孔[5]，后者较前者稳定性更好。现今NGS取得了令人瞩目的进展，正在发展成为分子显微镜，几乎涉及生物医学研究的每个领域[6]。
2 NGS在中枢神经系统感染中的应用
单核细胞增生李斯特菌是一种革兰阳性、兼性细胞内细菌，可以污染食物，摄入后可导致多种动物感染，包括牲畜和人类。单核细胞增生李斯特菌感染的严重程度取决于细菌菌株的毒力和宿主的免疫状态[7]。由单核细胞增生李斯特菌引起的脑炎虽很罕见，但有时是致命的。使用常规脑脊液测试很难早期诊断，而NGS越来越多地用于检测病原体。Yao等[8]收集了2014年1月至2014年10月期间入住北京协和医院的3例临床疑似李斯特菌脑膜脑炎的患者，征得同意后将3例患者纳入研究。在给予抗生素治疗之前，按照标准程序收集脑脊液，快速冷冻并在－20 ℃下储存。此3例急性/亚急性脑膜脑炎患者磁共振成像和血培养提示疑似单核细胞增生李斯特菌的诊断，而脑脊液培养是阴性的。在以上3种情况下，对收集的脑脊液进行NGS鉴定并测序，显示符合单核细胞增生李斯特菌的读数，并且获得了后期PCR检测结果的验证。首次报道了NGS在中枢神经系统李斯特菌感染中的应用。李斯特菌脑炎通常呈现双相病程。前驱症状包括发烧、头痛、恶心、呕吐，然后发展为进行性神经系统症状，甚至发展到呼吸衰竭[9]。此报道中有2例患者发生呼吸衰竭。因此，早期明确诊断和适当的早期抗生素治疗对预后至关重要。
王小娟等[10]为明确5例中枢神经系统感染患者的致病微生物，采用血液与脑脊液常规、生化、细胞学、培养、革兰染色等检测方法，应用BGISEQ-100测序平台进行脑脊液病原体测序。利用Premier设计了2对引物进行PCR验证，扩增后采用ABI Prisma3730XL型基因分析仪对其进行测序分析。脑脊液NGS共检测到李斯特菌的核酸序列数57～2 611条，平均730.8条。样本检出李斯特菌序列数与检出微生物核酸总序列比值为15.08%～90.84%，平均60.21%，检测深度为1，基因覆盖度为0.23%～14.00%，平均3.80%。NGS在李斯特菌检测方面具有优势，在较低基因组覆盖下也可有效识别出细菌病原体[11]。病毒性脑炎是遗传性原发性免疫缺陷患者发病和死亡的主要原因，如X连锁性丙种球蛋白血症[12]。Fremond等[13]报道了星状病毒感染的脑膜炎病例。患有X连锁性丙种球蛋白血症的14岁男孩，维持每3周高效价丙种球蛋白注射治疗，表现为进行性认知功能障碍、复发性癫痫发作，脑脊液、血液、痰和粪便等未发现病毒。脑脊液分析白细胞计数、葡萄糖水平和蛋白质水平是正常的，PCR和RT-PCR是阴性的，右侧额叶脑组织活检、组织学结果无特异性。采用NGS进行深度测序并进行分析，鉴定了星状病毒基因组大片段，显示出与VA1/HMO-C进化枝高水平同源性，获得了完整的基因组，并将该新菌株命名为HAstV-VA1/HMO-C-PA。更改治疗方案联合静脉注射利巴韦林治疗，患者运动行为、认知得到改善。NGS其中一个主要优点就是不仅限于细菌病原体，还可以检测鉴定真菌和病毒[14,15]。NGS在疾病诊断中的可用性越来越高。
3 NGS在肺部感染中病原体检测作用
肺部感染病发率较高，是临床很常见的呼吸系统感染性疾病，治疗不及时会发展为重症肺炎、呼吸衰竭等，预后很差，病死率高，严重威胁人类健康。He等[16]报告了3例侵袭性肺曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillosis，IPA)，其传染性强，病死率高。但IPA的临床诊断却很困难，很难获得微生物学证据。患者行常规的抗感染治疗症状未见好转。对以上3例患者进行支气管肺泡灌洗，使用NGS对支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)进行测试。在收到样品后48 h内，NGS即检测到3例患者BALF中烟曲霉的序列读数。其中2例患者BALF中的曲霉半乳甘露聚糖检测为阳性，1例患者使用传统方法检测为阴性，包括血清半乳甘露聚糖检测和BALF半乳甘露聚糖检测均为阴性，痰培养未发现真菌。即使接受治疗，患者仍有反复发热、咳痰、胸闷等症状，最后BALF通过NGS检测到烟曲霉，证实为IPA。3例患者均给予伏立康唑抗真菌治疗，上述症状逐渐好转，复查胸部CT病灶明显吸收。IPA是一种致命的机会性真菌感染，常发生于血液系统恶性肿瘤患者。然而在非传统宿主中也报道了许多IPA病例，尤其是COPD患者[17]。在这些非中性粒细胞减少患者中，更容易发生误诊事件[18]。因此，早期明确肺曲霉菌病诊断具有重要意义。Parize等[19]报道了一项多中心前瞻性研究，采用NGS技术对101例免疫缺陷患者进行病原体检测，同时送检血清、咽拭子、穿刺液体等标本。该前瞻性研究结果表明NGS较传统检测方法有较高的检出率以及更高的阴性预测值(64/65，95%CI：0.95～1)。NGS可检测出更多临床相关的病毒和细菌。因此，NGS是免疫功能受损或免疫缺陷患者病原体诊断的前景方法。Pendleton等[20]使用宏基因组学检测呼吸道病原体，报道了患有结缔组织病相关间质性肺炎的41岁女性患者和59岁败血症男性患者，使用宏基因组测序分别快速检测出铜绿假单胞菌菌株和金黄色葡萄球菌菌株。NGS在加速和改善临床常见致命疾病的诊断和治疗方面具有很大潜力。
结核分枝杆菌在肺部感染的病原体中也占据了重要部分。Nomura等[21]进行了一项回顾性研究，在心脏手术期间暴露于受污染的加热器-冷却器装置的患者容易感染分枝杆菌嵌合体(M.chimaera)。抗酸杆菌培养的诊断金标准通常需要侵入性取样。研究人员采用NGS方法对10例曾做过心脏手术的患者的血浆进行检测，同时对获取的标本进行抗酸杆菌培养。血浆NGS检测到10例患者中有9例患有侵袭性疾病，其检测所需的中位时间为4 d。其中7例患者血浆NGS是第一个提供M.chimaera感染病原学确认的试验。相反，抗酸杆菌培养物转为阳性所需的中位时间为20 d，确认M.chimaera的中位时间为41 d。该队列中获得的24个抗酸杆菌血培养物中，仅4个(17%)为阳性。其中90%的患者进行了侵入性手术，并且仅在5例患者(50%)的标本培养中提示了分枝杆菌生长。M.chimaera感染的患者因潜伏期较长以及其非特异性症状而不易被识别[22]。因此血浆NGS可以比抗酸杆菌培养物更快更准确地检测M.chimaera，使其成为一种很有价值的新型诊断工具。另一方面，结核分枝杆菌耐药也是全世界主要的健康问题之一。Ko等[23]应用NGS对易感结核分枝杆菌菌株和耐药菌株进行遗传分析，并通过估算NGS的阳性预测值和阴性预测值来检测菌株的耐药性。研究人员在Hallym大学医学中心收集了36株从临床标本中分离的结核菌株，通过培养基制作、核酸提取、PCR和基因测序、生物学信息分析、估计预测值及统计分析综合程序得出结果，共有24种变体与耐药性相关，基因型和表型都一致对异烟肼、利福平、乙胺丁醇敏感，对链霉素、阿米卡星反应较差，所有药物类别阴性预测值均大于97%，而阳性预测值为44%～100%。该研究成功地应用NGS进行了结核分枝杆菌耐药性、敏感菌株的遗传分析，获得了多态性和可能多态性列表，有可能成为在分枝杆菌试验中应用NGS的测试指导。
肺部感染的病原体很多，其中病毒感染也占据了重要的位置，而且病毒结构非常简单，且更易突变，临床上不易检测到。Yang等[24]使用大量寡核苷酸探针来富集34种呼吸DNA和RNA病毒的序列，减少NGS数据中的非病毒读数并实现了基于NGS测序病原体鉴定的高性能。NGS在靶向检测呼吸道病毒方面使用llumina MiSeq系统扩增和测序富集文库，实现了与分子测定相当的病毒检测灵敏度，并获得了每种病毒的部分甚至完整的基因组序列以获得精准的基因分型和变体分型。Wollants等[25]报道了1例中老年男性感染西尼罗河病毒，它是一种广泛存在的全球再生病原体，感染初始可能仅有流感样症状，随着病情发展可导致多脏器功能衰竭等危重情况。入院血象、尿沉渣、胸片、超声等均正常，对BALF进行多重PCR检测，结果显示22种不同的呼吸道病原体呈阴性。结核分枝杆菌的单重PCR结果也为阴性。免疫荧光和PCR检测卡式肺囊虫的结果仍是阴性。脑脊液分子诊断结果显示13种病原体呈阴性，血清学检测显示12种病原体呈阴性。采取NGS对BALF样本和病毒培养物进行检测，对NGS结果分析，确定了完整的西尼罗河病毒基因组(11 060 nt)。并且在BALF标本和细胞培养物上进行新的RNA提取和新开发引物逆转录PCR，并进行Sanger测序，该阳性标本序列与来自NGS获得的完整基因组的序列相同。分子检测是用于诊断呼吸道病毒性病原体的金标准方法，NGS较RT-PCR相比可提供更多的病毒序列和分型信息。所以，在传统方法检测病原体阴性时，NGS可成为识别临床标本中未知病原体的有力工具。
4 NGS在脓毒血症中进行病原体检测
脓毒症是由血流感染所引起的临床综合征，并且脓毒性休克是患者对治疗措施反映出治疗不佳的一种临床表现[26]。脓毒血症患者病死率在全球范围内很高，尤其是在不能及时明确病原体和抗生素非合理使用的情况下病死率会进一步增加[27]。Abril等[28]报道了1例牧羊犬咬伤的60岁男性患者，1周后出现体温升高、心率加快、血压下降，经验使用广谱抗生素治疗。入院血培养阴性，脑脊液革兰染色和单纯疱疹病毒PCR均为阴性。收集患者血浆标本进行NGS，24 h内NGS分析检测到高水平微生物DNA，其读数沿整个犬咬二氧化碳嗜纤维菌(C canimorsus)基因组排列，检测出C canimorsus，之后并对血培养物分离进行16S rRNA测序确认。该病例首次报告了其在脓毒症重症患者中的应用，突出了NGS在临床有限时间范围内提供相关诊断性数据的巨大希望，并对改善抗生素治疗具有重要意义。
Grumaz等[29]报道了1篇关于NGS技术应用于脓毒症患者病原体检测的观察性研究，纳入了25例患者，其中包括7例脓毒症患者、12名健康志愿者、6例接受过腹部手术的患者(在该研究中分析了不同时间点的血浆)，总计62份血浆样本，同时进行厌氧血培养、需氧血培养、PCR检测、伤口拭子、导管和粪便标本培养，以及NGS对血浆标本进行检测。脓毒性休克患者的cfDNA浓度水平增加(平均197.23 μg/L)，尤其在脓毒症发病期间(平均377.30 μg/L)；并且与对照组相比发病期间脓毒症患者的平均分类读数较高(9.82%)，明显高于健康组(3.50%)和腹部手术前组(2.64%)，这表明脓毒症患者细菌负荷较高。而且在血浆样本中发现了来自致病细菌显著水平的DNA片段，检测出病原体有阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单纯疱疹病毒、肺炎克雷伯菌、脆弱拟杆菌，并在28 d试验期内完善通过传统方法检测到的病原体数据，其与NGS检测结果匹配，从而得到证实。所以，该方法有望成为脓毒血症患者比较有前景的诊断方式。
5 结语与展望
现今感染性疾病发病率越来越高，随之而来的疑难病原体感染发生率也逐渐增加，从而加大了临床医师诊治的难度。若诊断不明确、治疗不及时，病情会迅速进展，乃至发生重症炎症、多脏器功能衰竭等危重疾病，甚至死亡。NGS技术不断发展，改变了基因组分析，为临床微生物实验室的应用开辟了很多新机会，其快速无偏的特性补充了传统方法检测病原体的不足，有很好的临床使用价值。但NGS目前仍缺乏相关公认的标准，又因价格较昂贵，临床上仍以传统方法检测为主，目前NGS总体使用率仍不高。但随着社会的快速发展，有理由相信NGS在未来临床感染性疾病中的使用会更加广泛，利用其快速精准明确病原体的优势，成为临床上一项重要的医学检验技术。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献略
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