2023-03-06 23:06·
干细胞者说间充质干细胞的扫描电镜图 Steve Gschmeissner/SPL
“你之所以活着，是因为你不断地更新各种组织和器官，或让它们恢复活力。在体内，皮肤、肠道和血液等细胞逐渐成熟，在一段时间内发挥功能，然后过期，被不断更新的细胞取代，从而更新组织。在每一个发生这种年轻化过程的组织中，都存在一个产生这些分化细胞的来源。这个来源被称为 '干细胞’。”
美国生物学家 Arnold Caplan 在他的主页上这样写道
● ● ●
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）具有强大的体外增殖能力和多向分化潜能。在机体调控下，间充质干细胞能够不断地由原组织位点向新组织位点迁移，在生理或病理条件下参与组织的更新和修复，以维持机体组织形态的完整性和功能的稳定性。
间充质干细胞免疫原性较低，一般不会引起宿主的免疫反应。这种特性使其在自身免疫病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。
-01-间充质干细胞来源与分布
以时间轴为主线，我们讲述MSCs的研究历程上比较重要的事件。（1）1976年，Freidenstein等首次发现在骨髓里存在一群非造血的骨髓基质细胞，呈克隆性贴壁生长，形态和成纤维细胞相似。由于这些细胞具有多能性，可以分化为中胚层组织，如肌肉、肌腱、韧带及脂肪组织等。
（2）1988年，Freidenstein和Owen 将其命名为骨髓基质干细胞（MSCs）。
（3）1992年，Arnold Caplan进一步定义了“间充质干细胞”。“间充质干细胞”的命名被学术界和产业界广为接受和使用。
（4）1995年，Arnold Caplan从恶性血液病患者骨髓分离培养出贴壁的基质细胞，然后输注到患者体内，观察临床效果并验证其安全性。从此，开启了第一例间充质干细胞的临床应用。
（5）再后来，Arnold Caplan成了全球第一家间充质干细胞公司——大名鼎鼎的 Osiris Therapeutics 公司的创始人。
（6）2012年，加拿大有条件获批Osiris Therapeutics公司开发的间充质干细胞注射液（Prochymal）作为药品上市，用于儿童移植物抗宿主病（GVHD）的治疗。
（7）2019年，Arnold Caplan教授建议将间充质干细胞改为医用信号细胞(medicinal signaling cells，MSCs)，虽然英文缩写也是MSCs。
间充质干细胞异质性比较大，无法定其最初发育起源（请问人体的第一个间充质干细胞到底是怎么来的，单细胞测序技术可以告诉我们吗？）。间充质干细胞像野草一样广泛存在于人体几乎所有组织中，包括成体组织和新生儿组织（如骨髓、血液、脐带脐血、胎盘、脂肪组织、羊膜羊水、牙髓、皮肤、甚至经血等等）。
图1：MSCs来源于不同组织[4]
-02-间充质干细胞的定义自间充质干细胞的概念提出之后，间充质干细胞的来源组织类型越来越多的被人发现。这就需要对间充质干细胞的定义有一个明确的标准。
2006年，国际细胞治疗协会（ISCT）给出了间充质干细胞定义的最基本定义，也就是间充质干细胞最低的鉴定标准：
[1] MSCs在标准培养条件下，呈贴壁生长；
[2] MSCs表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19及HLA-DR表面标记；
[3] MSCs在体外诱导可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞
然而，不同来源的间充质干细胞表面分子特征差异巨大[3]。虽然不同组织来源的间充质干细胞均能符合国际细胞治疗协会（ISCT）制定的最低标准，但依然有不少研究的结果提示不同组织来源的间充质干细胞具有差异性（比如细胞大小、增殖潜能、分泌细胞因子种类和数量，免疫抑制能力也不尽相同）。
-03-间充质干细胞生物学特性间充质干细胞是一类典型的异质性细胞群体，能够自我更新并具有多向分化潜能。大多数间充质干细胞，可以作为中胚层组织如骨骼、脂肪和软骨发育的前体细胞，同时还可以跨越胚层横向分化为各种组织细胞，如神经细胞和内皮细胞等[5,6]。
图2.间充质干细胞的基本生物学特性间充质干细胞具有强大的分泌功能，能够表达、合成和分泌各类生长因子、细胞因子、调节因子、信号肽等多种生物活性分子。间充质干细胞主要有免疫调控，抗细胞凋亡，促进血管生成、支持干/祖细胞的生长和分化、抗疤痕、趋化作用等六大功能。间充质干细胞分泌的活性因子富含诸多生长因子（如VEGF、EGF，bFGF、HGF等），还可分泌诸多细胞因子（IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、GM-GSF、TGF-β等）。
图3.间充质干细胞的旁分泌功能
间充质干细胞，可产生相应的生长因子和细胞因子在组织修复过程中发生作用，如骨形态发生蛋白（BMP）在骨、肌腱、软骨的修复中发挥作用，促血管再生因子（VEGF）可用于缺血性疾病的治疗。间充质干细胞由于来源广泛、易获取、易分离、体外能短时间内大规模扩增、冻存后生物学效力损失很小、免疫原性小、安全性高等特性，已广泛应用于临床研究。
-04-间充质干细胞的免疫调节作用
间充质干细胞是一类低免疫原性的成体干细胞，其低免疫原性主要是与其只表达MHC-Ⅰ，不表达MHC-Ⅱ有关。同时，间充质干细胞对各类免疫细胞均具有免疫调节作用。
间充质干细胞对免疫系统的作用以负调控为主。
● 单核细胞：单核细胞可分化为M1型巨噬细胞起促炎作用或分化为M2型巨噬细胞起抗炎作用。MSCs分泌IL-1RA、IL-10、CCL-18促使M1向M2转化，通过影响Treg的形成，起到抗炎症与抑制T细胞功能的作用。● 中性粒细胞：在体内，MSCs能够通过加强中性粒细胞抗菌能力起到辅助清除细菌的作用，此外还能抑制中性粒细胞凋亡，延长中性粒细胞寿命。● 树突状细胞：作为体内最主要的专职抗原提呈细胞，树突状细胞（DC）能够有效刺激T细胞和B细胞的活化，激发机体免疫应答。体外实验证实MSCs能够显著地减少单核细胞向DC细胞的分化，维持DC细胞的未成熟的状态，从而使DC不能有效地活化初始T细胞和刺激T细胞增殖。● T细胞：MSCs主要通过释放可溶性因子、细胞间的直接接触以及诱导Treg生成等三种方式抑制T细胞功能，这种抑制作用呈剂量依赖效应。● B细胞：MSCs主要通过分泌一种细胞因子抑制B细胞增殖，使B细胞的细胞周期滞留在G0/G1期来达到目的。MSCs能够产生趋化因子受体CXCR4/5/7来改变B细胞的趋化能力。
图4. 间充质干细胞的免疫调节作用
-05-间充质干细胞的表面标记物
作为一种异质性细胞群，间充质干细胞并没有特殊的表面标记物可以表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。不同的表面标记物可能代表间充质干细胞不同的潜能。
众所周知，间充质干细胞的生物学效力和增殖能力，随着传代次数的增加逐渐下降。而标准表面标记物 CD73、CD90 和 CD105 在传代的早期和晚期均稳定表达，虽然这些标记物也并非间充质干细胞特有的。
图5 不同表面标记物可能代表 MSCs 的不同潜能
CD29：CD29（即整合素β1,VLA-β链或gpIIa），为多种细胞外基质蛋白的受体，属于整合素家族。CD29作为纤维连接蛋白受体，参与多种细胞-细胞和细胞-基质相互作用，调节多种重要的生物学功能，包括胚胎发育、伤口修复、止血和防止细胞程序性死亡。它的表达与MSCs的迁移有关。
CD44：CD44（即Hermes、Pgp1、H-CAM或Hutch），是一种糖蛋白。它表达于白细胞、内皮细胞、肝细胞和间充质细胞。CD44是一种粘附分子，CD44抗原是一种细胞表面糖蛋白，CD44参与多种细胞功能，包括淋巴细胞活化、再循环和归巢、造血和肿瘤转移。
CD73：CD73（即NT5E），是一种5′-核苷酸外切酶。它是一种锚定的表面蛋白。CD73广泛表达于包括淋巴细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和成纤维细胞在内的多种细胞。CD73不仅可参与嘌呤核苷酸的补救合成途径，还可作为一种重要的免疫信号分子，参与跨膜信号转导及细胞的黏附。CD73在间充质干细胞表面的稳定表达是鉴别MSCs重要的表面标记之一。
CD90：CD90（Thy-1），是一种锚定蛋白。它属于免疫球蛋白超级家族。人CD90表达于神经细胞、CD34+细胞亚群、胎肝细胞亚群、胎胸腺细胞亚群、成纤维细胞、活化内皮细胞和某些白血病细胞系。Thy-1与与细胞的黏附、分化、细胞间相互作用有关。它是人类微血管内皮细胞活化的标记，与新生血管的形成有关[10]；也是鉴别人类MSCs的重要标记[11]。
CD105：CD105（即Endoglin），是一种跨膜糖蛋白。在血管生成的组织中，如肿瘤、伤口愈合或真皮炎症中，CD105在活化的内皮细胞上的表达增加。CD105在血管发生发展过程中起着重要的作用，它可以维持血管的完整性[12]。也是鉴别人类MSCs的重要标记。
CD146：CD146（即黑色素瘤细胞粘附分子，MCAM），一种具有跨膜结构的黏附分子，属于免疫球蛋白超家族成员。CD146在多种细胞生理过程中表现活跃，包括发育、信号转导、细胞迁移、间充质干细胞分化、血管生成和免疫应答。CD146与MSCs的细胞衰老和“干性”有关，CD146表达逐渐减低，是细胞衰老和干性减弱的一种迹象。
CD166 ：CD166（即CD6配体或活化的白细胞粘附分子，ALCAM），属于免疫球蛋白超家族成员，是一种跨膜糖蛋白。它表达于活化的T细胞、活化的单核细胞、上皮细胞、成纤维细胞和神经元。可能参与T细胞的发育和调节，可能在神经系统中发挥作用，在维持MSCs多向分化潜能方面起着至关重要的作用[14]。
STRO-1：Stro-1也是研究常用的标志物，但在很多研究中均未提及。作为寻找间充质干细胞可靠标志物的实验研究的一部分。Stro-1曾被认为是著名的MSCs标记物，其抗体主要用于流式细胞术以及对可能的MSCs进行染色。
SSEA-4：SSEA即阶段特异性胚胎抗原，是一种糖蛋白，常表达于胚胎发育早期，在未分化的干细胞中SSEA也常为阳性。SSEA-4是检测MSCs是否具有干性的一个标记物。
-06-干细胞和干细胞分泌组干细胞临床应用面临许多挑战，稳定性和安全性是其中重要因素。干细胞是活的药剂，对周围环境高度敏感，因此需要一个严格控制的环境，以确保产品（安全，无菌，表面标记物，活性，纯度和效力）的公认标准都得到保证。（从细胞收获到给病人使用的时间）
体外长期扩增可能会导致基因组突变，但并无证据表明衰老与间充质干细胞恶性转化有关。但出于安全和细胞效力考虑，建议尽量避免使用可能衰老的细胞。通常，间充质干细胞在衰老前，可在体外进行20~40倍扩增。Barkholt 等人建议尽量减少间充质干细胞体外扩增倍数，以降低染色体异常的可能性。ADIPOA-2临床试验，就将最终产品细胞扩增倍数限制在7.2倍内（即平皿培养体系中的细胞代数从p1-p16）。
另外，细胞治疗产品在临床应用之前，需要小心保存和加工。避免这些安全性问题，同时又要保留细胞治疗的优势，一种可行方法是使用干细胞分泌组（注：分泌组包含外泌体、外囊泡和其他可溶性细胞因子）来代替细胞进行应用。越来越多的证据表明，成体干细胞的组织再生修复能力主要是由于它们的旁分泌活性因子介导的，这种旁分泌效应是依赖于各种分泌物实现的。
图6.干细胞分泌组
因此，可以运用干细胞分泌组对疾病（比如烧伤烫伤，银屑病、系统性硬皮症、糖尿病足等）进行治疗研究。既可以避免干细胞移植存在的免疫反应，也可减少潜在的促瘤性风险，也更容易长期存储，实现标准化和规模化应用。但是对于干细胞分泌组的稳定性和发挥效果的机理，还需要进一步研究。
-07-间充质干细胞的治疗效果的思考
想要提高间充质干细胞的治疗效果，必须提高干细胞的归巢率，那么，细胞如何能够到达受损部位，是首先要考虑的问题。
1. 细胞质量的考虑
干细胞长期传代会导致其干性减弱或者丢失，会影响临床治疗效果。在体外培养时间越长，发生老化以及细胞间的氧化损伤积累的可能性就越大，使细胞的增殖能力和归巢潜能有所减弱。
因此，缩短干细胞在体外扩增时间，有助于提高其归巢性，增强其临床效果。在没有完成规模化制备细胞工艺之前，尽量选择代数/倍增次数靠前的细胞（在规模化标准化的条件下，群体倍增次数才是靠谱的，而细胞代数是实验室概念，指的是细胞群从培养器皿中移出，再次接种培养过程的次数）。
2. 给药方式的考虑
干细胞目前常见的给药方式是循环系统给药（静脉注射，动脉注射），局部注射。静脉输注由于操作简便、侵袭性小、可重复性强，所以治疗中最常使用。静脉输注是最常用和最简单的给药途径，但存在发生滞留肺部影响效果的可能。肺部能清除超过60%的细胞，造成趋化到损伤部位发挥治疗作用的细胞数量减少。
因此，针对某些疾病，如果要想提高疗效，尽量会将干细胞“送到”损伤位置进行修复。比如局部注射，腰穿，介入等方法，会提高其归巢性和发挥更好的里临床效果。（具体给药的方式选择，取决于很多因素，比如适应症）
局部给药，包括脊髓鞘内注射（常见于神经系统病变），局部注射（关节腔内注射，椎间盘，心肌注射，肌内注射，气管注射）；结合生物材料（适用范围较多，如神经损伤，烧伤烫伤，膝关节炎，子宫内膜损伤，椎间盘等等）
3. 使用冻存细胞还是新鲜细胞
目前使用的细胞有两种形式：一种是新鲜制备的细胞，一种是冷冻后复苏的细胞。相对于新鲜制备的细胞，冷冻后复苏的细胞很多生物学功能没有恢复。刚复苏的细胞，归巢性和存活率都会受到影响，黏附贴壁是移植干细胞存活、生存和有效的前提。研究发现，在移植前使间充质干细胞的处于黏附贴壁状态，会有利于移植后的细胞生存和向目标组织的归巢。因此，新鲜制备的细胞要比刚复苏后的临床效果要好（但如何进行规模化制备和长距离运输，建立区域制备中心吗？）。
4. 细胞移植数量的思考
移植时间及数量影响其归巢的效果，细胞越早期，移植后归巢率越高。如果原代细胞数量足够，不经过体外培养最好。体外培养时间越短，干细胞越容易保持干性，归巢性会好。刚分离出的细胞往往数量稀少，通常要在体外进行大量培养扩增，以增加干细胞数量。所以，移植时间与细胞数量也是一个矛盾。这意味着，为了获取足够数量的原代细胞，体外扩增的时间就会短一些，也会有助于其发挥其临床效果。
-08-国际获批的间充质干细胞产品
目前全球批准的间充质干细胞药物共有 10 种，但没有一款获得美国FDA 的批准。根据作用机制和批准的适应症，间充质干细胞产品可分为两大类：组织修复和免疫调节。
通常，间充质干细胞产品会根据两个生物学特性来选择适应症，如移植物抗宿主病、膝骨关节炎、克罗恩病，严重下肢缺血等。市场定价也各不同，欧美市场定价高于东亚市场（日韩）定价，市场销售情况普遍均不乐观。
三种基于组织修复的间充质干细胞产品，已获批准。（1）2010年，韩国KFDA批准一种自体脂肪来源的细胞产品Queencell，适用于皮下组织缺损的治疗。不过，Queencell并非由单一MSCs组成，而是由MSCs、周细胞、肥大细胞、成纤维细胞和内皮祖细胞的混合细胞组成，类似于SVF。
（2）2011年，韩国KFDA批准MSCs的组织修复产品Cellgram， 适用于治疗急性心肌梗死。
（3）2012年，韩国KFDA批准MSCs的组织修复产品Cartistem，适用于重复性和/或创伤性软骨退行性病变，包括退行性骨关节炎。
七种基于免疫调控的间充干细胞产品，已被批准。
（1）Cupistem，一种自体脂肪来源MSCs产品。2012年获得韩国KFDA批准，适应症是克罗恩病复杂肛周瘘。
（2）Prochymal，一种异体骨髓来源MSCs产品。2012年获得加拿大CFIA批准，适应症是儿童类固醇难治性急性GVHD。
（3）Alofisel，一种异体脂肪来源MSCs产品。EMA批准的唯一MSCs产品，适应症是克罗恩病复杂肛周瘘。作用机制主要是MSCs抑制活化淋巴细胞增殖从而减少促炎细胞因子产生。
参考资料：
[1] Friedenstein A J, Chailakhyan R K, Gerasimov U V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers [J]. Cell proliferation, 1987, 20(3): 263-272.
[2] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement [J]. Cytotherapy, 2006, 8(4): 315-317.
[3] Mendicino M, Bailey A M, Wonnacott K, et al. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective [J]. Cell stem cell, 2014, 14(2): 141-145.
[4] Caplan A I. Mesenchymal stem cells: time to change the name! [J]. Stem cells translational medicine, 2017, 6(6): 1445-1451.
[5] Kopen G C, Prockop D J, Phinney D G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(19): 10711-10716.
[6] Pittenger M F, Mackay A M, Beck S C, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells [J]. science, 1999, 284(5411): 143-147.
[7] Lu L L, Liu Y, Yang S G, et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials [J]. haematologica, 2006, 91(8): 1017-1026.
[8] Fakhry M, Hamade E, Badran B, et al. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts [J]. World journal of stem cells, 2013, 5(4): 136.
[9] Mohr S, Portmann-Lanz C B, Schoeberlein A, et al. Generation of an osteogenic graft from human placenta and placenta-derived mesenchymal stem cells [J]. Reproductive sciences, 2010, 17(11): 1006-1015.
[10] Saalbach A, Hildebrandt G, Haustein U F, et al. The Thy-1/Thy-1 ligand interaction is involved in binding of melanoma cells to activated Thy-1-positive microvascular endothelial cells [J]. Microvascular research, 2002, 64(1): 86-93.
[11] He J, Liu Y, Zhu T, et al. CD90 is identified as a candidate marker for cancer stem cells in primary high-grade gliomas using tissue microarrays [J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2012, 11(6): M111. 010744.
[12] Gerlach J C, Johnen C, Ottoman C, et al. Method for autologous single skin cell isolation for regenerative cell spray transplantation with non-cultured cells [J]. The International journal of artificial organs, 2011, 34(3): 271-279.
[13] Phelps E A, García A J. Engineering more than a cell: vascularization strategies in tissue engineering [J]. Current opinion in biotechnology, 2010, 21(5): 704-709.
[14] Laschke M W, Harder Y, Amon M, et al. Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes [J]. Tissue engineering, 2006, 12(8): 2093-2104.
[15] Kolf C M, Cho E, Tuan R S. Mesenchymal stromal cells: biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation [J]. Arthritis research & therapy, 2007, 9(1): 204.
[16] Lin C S, Ning H, Lin G, et al. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? [J]. Cytotherapy, 2012, 14(10): 1159-1163.
[17] Gangenahalli G U, Singh V K, Verma Y K, et al. Hematopoietic stem cell antigen CD34: role in adhesion or homing [J]. Stem cells and development, 2006, 15(3): 305-313.
《自然 · 综述》：T细胞在衰老中的角色
— END —
