你有过吃到美味的食物完全停不下来的经历吗？哪怕心里一遍又一遍地对自己说：不行！就吃最后一口！热量太高了！可是身体还是诚实地把面前的食物饮料一扫而光？路过知名的奶茶店，忍不住买了杯香喷喷的奶茶在手，心里宽慰自己道：就撮一口解解馋，可是一不留神，吸管就见底了，哪怕是在刚刚饱餐过后？一天到晚叫嚷着要减肥的你或是有着糖尿病、脂肪肝的你这个时候是不是特别懊恼：为什么我就管不住我的嘴？明明医生叮嘱要少吃多餐，多餐做到了，每顿少吃怎么就那么难？你会因此有负罪感，埋怨自己意志力不够坚定。可是常常屡次埋怨、屡次依旧。
怎么回事？难道怪食物和饮料太好吃太可口？听起来像是为自身努力不够而找的借口。可是没错！这还真是其中的重要原因。我们常常习惯于用个人意志力或是道德行为规范来解释很多常见的行为模式，却不知人的行为其实是由我们的大脑来控制。你做出的每一个决定，哪怕是潜意识的，都来自于大脑结合了各种外部信息和内在偏好之后的运算输出。在某种意义上，关于吃的自由意志并不存在。我们所设想的个人意志力或是行为规范在神经科学领域都有它们具体的物质载体。
2020年8月24日，Janelia Research Campus 霍华德休斯顿医学研究所Scott Sternson课题组的在Cell杂志上在线发表了题为 hindbrain double-negative feedback mediates palatability-guided food and water consumption 的研究。这项研究表明，贪念美食的你可能拥有一个对美味食物和饮料比别人更加敏感的特殊大脑区域。
背景介绍
本能驱动行为 （motivated behavior）包括生物个体的进食行为、摄水行为、性行为、养育行为等等，是保证生物个体甚至种群生存的关键。动物大脑在不同的环路水平上对这类行为有一系列精确的控制，来保证这类行为在不同的条件下都能合适、正确的执行。一般来说动物的本能驱动行为（motivated behavior）分为三个阶段：寻觅阶段（preparatory behavior），消费阶段（consummatory behavior）和满足阶段（satiety）。在寻觅阶段，动物会根据个体内在需求对特定事物或行为产生欲望，从而开始周围环境中寻找特定的目标。譬如在进食行为中的这个阶段，动物会产生饥饿感，从而把行为注意力从其他事物转移到寻找食物这个特定行为中；在消费阶段，动物已经在外界环境中发现内在需求的目标所在，会和所需求的目标产生一系列直接的相互作用，这其中包括相应的感官探测、奖赏信息处理和运动输出。在进食行为中的消费阶段包括闻嗅食物的气味质地、品尝食物的味道以及进一步地摄取食物；在消费阶段中动物会逐渐产生对特定目标的满足感，从而慢慢过渡到满足阶段。在这种情况下，动物从原来的本能驱动行为中解放出来，得以把注意力转移到其他行为中。
对于本能驱动行为的研究，很长一段时间都集中在探索动物如何产生本能驱动力、进入寻觅阶段。譬如位于下丘脑的AGRP神经元或者SFONOS1神经元，这类神经元被体内激素激活后都会分别促进动物进入觅食或者觅水阶段，从而产生我们常见的进食或摄水行为。之前大量的在体记录和行为干预实验证实，AGRP 神经元或者SFONOS1神经元的激活是产生饥饿感或是口渴感所必须的。但是，有趣的是，这两类神经元都在动物进入消费阶段后都降低了它们的反应活性。譬如，AGRP 神经元在小鼠看见食物或是闻到食物气味后就被抑制，即使小鼠还没有真正吃到。似乎监测体内饥饿或口渴需求的神经元的活性仅与寻觅阶段密切关联。那么问题来了：如果产生饥饿感或口渴感的AGRP 神经元、SFONOS1神经元只负责小鼠本能驱动行为中的寻觅阶段，那么大脑中什么脑区、什么神经元编码和控制本能驱动行为中消费行为的产生呢？觅食（水）、进食（水）这样的连续性行为必然存在一个在神经环路上从上到下相关联的若干脑区的参与。
实验方法
全脑结构、功能筛查
进食和摄水行为在较高等的生物中属于完全不同的两类本能驱动行为，传统的labeled line hypothesis认为不同类的本能驱动行为分别由不同的神经环路调节和控制。但在消费阶段，进食和摄水两类行为呈现很多相似的特性。譬如，初期对食物或水源的观察、闻、尝来判断可食性，最后通过面部肌肉和舌头的协同作用完成咀嚼或吸允动作。因此，我们判断通过寻找饥饿和饥渴环路中存在的共同脑区可以增加找到特异性负责消费阶段脑区的概率。
神经元中CFOS的表达常常与神经元的兴奋性活动有关，传统意义上被认为是神经元激活的标志; 经过特殊改造过的单纯疱疹病毒 （HSV）能够正向跨越多级神经元突触，从而标记出出发神经元的下游神经元。利用这两个工具，可以分别从下丘脑的AGRP神经元和SFONOS1神经元作为出发点，来标记两种神经元的多级下游功能性脑区以其神经元。
我们首先在AGRP神经元或SFONOS1神经元中特异性表达光遗传受体，利用激光特异性分别激活这两类神经元，然后将全脑进行组织切片、CFOS特异性免疫染色、图像扫描以及全脑重构，获得下游神经环路中被这两类神经元激活的神经元信息；同时，在另外两组小鼠中，把表达红色荧光蛋白的单纯疱疹病毒分别特异性表达在AGRP神经元或SFONOS1神经元中，经过24小时到72小时的孵育时间，将大脑取出，同样进行组织切片、图像扫描和全脑重构，可以知道在神经环路上与这两类神经元直接或间接联系的下游神经元。最后获得的所有数据（两组CFOS表达、两组HSV标记）通过图像的处理和分类获得较为客观的全脑CFOS表达和HSV标记信息。之后将这类图像与标准脑的图像进行配准（registration）， 得到一致的大脑结构信息。根据这些数据，可以准确地直接比较不同实验组中相同结构中的CFOS表达以及HSV标记，从而找出AGRP神经元和SFONOS1神经元共同的下游功能性脑区。值得强调的是，这样的方法不局限于以往研究的两类神经元直接的下游脑区，而是把目标扩展到两类神经元下游跨越多级突触连接的下游脑区，极大地扩展了可能的研究对象，更有利于客观且准确地发现以往未发现的功能脑区以及神经元。
图1：四种实验组小鼠通过两类标记方法找出共同的下游脑区
单细胞形态全脑重构
根据全脑筛选，确定所研究脑区periLC后，我们还重构展示了一些该脑区直接上游脑区的单细胞形态。通过以往的研究，这些上游脑区与进食或摄水行为的不同阶段都密切相关，譬如侧下丘脑（lateral hypothalamus）、丘脑的zona incerta (ZI)、背中部下丘脑 (dorsal medial hypothalamus, DMH) 等等。这类脑区的部分单细胞直接投射到所研究脑区periLC内，进一步增加了periLC直接参与到进食或摄水行为的可能性。
往小鼠头部注射混合有低滴度表达Cre蛋白的病毒和高滴度编码有Cre依赖性表达的荧光标记物的病毒，一定孵育时间后，能够实现单个或极少量的神经元显著标记。标记过的小鼠大脑通过去脂等一系列处理，可以将原本乳白的大脑变得透明，显著增强激光在大脑样本中的传播。之后透明化的小鼠大脑还通过全脑组织免疫染色来进一步增强荧光标记物信号，最后通过双光子显微镜扫描和自动切片来获取荧光标记物在全脑中的信息。扫描后的图像同样通过全脑重构和与标准脑的配准，最终得到标记的单个神经元在全脑的分布形态。这其中不单包括神经元胞体所在的位置，还包括神经元轴突、树突的各个分支的形态信息。
在自由运动小鼠中脑干区域的在体钙成像
脑干位于后脑的位置，与脊椎直接相连。在小鼠、大鼠、人中，这一区域的脑上方分布着致密的脑部大血管，通常一旦破裂，便会造成脑休克甚至危及生命。另外由于脊椎动物的运动习性，使得脑干在动物运动过程中总是处于一个“不稳定”的状态：它会随着脖子的扭动，处于前后左右摇晃的状态。在哺乳动物中，由于脖子的灵活性增加，这种摇晃的状态更加敏感。这给动物清醒状态下脑干在体单细胞水平活性的研究带来了很大的难度。而以往麻醉状态下小鼠脑干区域的记录都表明，神经元的活动在此种状态下对外界的刺激都大打折扣，因此对清醒状态下特别是动物自由运动状态下该区域的在体单细胞水平活性的研究成为研究这类脑区的迫切需求。如何解决这一技术难题成为该研究的关键。
经过大量反复的尝试，我们通过置换GRIN 植入镜片位置的方法，巧妙地避开了脑干区域大血管。更重要的是，通过对传统GRIN 植入镜片的改造显著增加了钙信号在体记录的稳定性：附着于GRIN 植入镜片四周的钨丝纤维嵌入记录脑区的下部区域，增加了GRIN 植入镜片相对稳定性，从而保证小鼠在自由运动过程中GRIN 植入镜片的位移与下部要成像的脑区保持一致性。这种方法成功解决了在小鼠自由运动状态下脑干区域稳定进行细胞水平钙成像的难题，为将来更加细致化地在哺乳动物体内研究这一大脑区域提供了关键性的技术基础（脑干区域稳定的头戴式显微成像技术）。
视频1：在GRIN植入镜片侧面装配上稳定用的钨丝后，在自由运动小鼠periLC区域的钙成像动态监测过程中看到的视野稳定性（下）要远高于传统用于小鼠深部脑区钙成像（上），从而为在自由运动小鼠中稳定记录这类神经元活动提供了保障。
光遗传学介导的特异性行为干预
最近十几年光遗传学介导的特异性干预成为神经科学领域的一项重要工具。根据动物行为过程中在体钙成像的相关性研究，可以粗略观察到大脑中大量的单个神经元活动和行为之间的相关性，而进一步的系统分析或建模则能帮助我们推测到这些形态、活性各异的神经元可能直接参与或控制的行为变量。但必须认识到，这一步的实验结果还依然处于假设阶段。相关性的研究仅提供了这些神经元功能的可能性，要验证这个结论必须通过所建模型或假设对这些神经元的活性进行目的性地干预，将此种情况下所得的动物行为结果与模型或假设预测结果进行对比，从而来验证所提出的模型或假设的正确性。在这个课题中，我们很好地结合了自由运动状态下在体神经元钙成像活性研究、假设推理以及光遗传学介导的特异性干预等实验方法成功揭示了脑干periLC的特异性功能。
实验结论
脑干的periLCVGLUT2神经元介导了可口性信息控制下的消费行为
通过实验方法中提到的对AGRP神经元和SFONOS1神经元的下游全脑结构、功能筛查，我们挑选出位于脑干区域的鲜有研究、功能未知的periLC脑区进行细致的分析。经过一系列实验，我们证实PeriLC区域谷氨酸神经元 （periLCVGLUT2）特异性地介导了由摄取食物或饮料的可口性信息控制的消费行为。
periLCVGLUT2神经元仅在小鼠进食或摄水的消费阶段呈现出特异性抑制或激活反应，在寻觅阶段则没有显著性变化。进一步研究表明这类神经元的特异性反应中，被食物或水激活的神经元更多是代表了所摄取物的刺激性性质（valence value），根据性质“好坏”，具有反应特异性，而被抑制的神经元则代表的是摄取食物或水的可口性信息，具有广谱的感受野（receptive fields）。具体来讲，这类抑制性反应的神经元对所有摄取的食物或水都有呈现出抑制性反应，但是差别就是：从这类神经元整体来讲，摄取的食物或饮料越可口，群体抑制性反应越强。某种程度上，这群在消费阶段抑制性反应的periLCVGLUT2神经元的抑制反应大小代表了食物或饮料的可口性强弱。通常食物或饮料的可口性信息包括它们的味觉、触觉以及气味信息的综合，在这里我们特异性研究了其中味觉信息的影响。确实，在有这类具有广谱感受野的periLCVGLUT2神经元群体中，在饮用同等体积的情况下，不同味道的溶液摄取能够产生与可口性成正相关的抑制性反应大小。
根据这个现象，我们还在消费阶段特异性地抑制这类periLCVGLUT2神经元，能够模拟产生可口性迁移的现象（palatability shift）：即使小鼠正在吃普通的食物或毫无味道的水，也能够通过关抑制误让小鼠认为正在摄取非常美味可口的食物或饮料，从而更长时间地停留在消费阶段，维持消费阶段的延续，一次性摄取更多的实际上口感普通的食物或水——相当于在没有增加饮食次数的情况下，通过增加每顿饮食的量来增加整体的饮食量。
根据我们平日的经验，美味的饮食会诱使我们每次多吃，也会诱使我们更高频率的消费。但我们的大脑明显把这两类行为是分开处理的。更高频率地消费过程是不断重复寻觅阶段的行为，它由大脑中AGRP神经元、SFONOS1神经元或其他尚未发现的神经元介导；每次更加大量消费的过程是延长停留在消费阶段的行为，它则由periLCVGLUT2神经元介导。因此，好吃的食物或饮料，我们会控制不住地多吃；难吃的，尝一口就够。
个体内在状态对PeriLCVGLUT2神经元的编码有明显调节作用
periLC位于饥饿环路和口渴环路的共同下游，所以也被饥饿或口渴这样的内在状态所调节。神经元钙成像研究证实，饥饿和口渴状态对periLCVGLUT2神经元的抑制性反应有显著调节作用：对比饥饿或口渴状态和温饱状态下对相同饮食的反应，在摄取量相同的情况下，前者能显著增加periLCVGLUT2神经元抑制性反应。
与此现象相关的是，动物个体的能量储存状态能够显著调节个体对饮食的可口性判断。《堂吉诃德》中有一句至理名言 “hunger is the best source”。意思就是说，人在饥渴状态下，一切食物看起来都是那么美味，哪怕是平时看起来毫不起眼的边角料。那么与之对应的消费行为则是：我们在饥饿的状态下吃的饭食比温饱状态下要多得多，因为主观上它们更加美味。
在小鼠自由摄食行为中，从饥饿到温饱这一逐渐变化的过程中，可以观察到小鼠每次进食的时间长度是逐渐变短的。由于在我们实验体系中，进食时间长度仅与进食量正相关。所以可以说，从饥饿到温饱过程中，小鼠每次进食的量是逐渐减少的，可以预测小鼠在这个过程中感知食物的可口性也是随着饥饿到温饱这一动态过程逐渐变化的。与这种推测相对应的实验结果是，periLCVGLUT2单个神经元的抑制性反应在从饥饿到温饱过程中的表现出不同的反应大小：饥饿时，摄取饮食的消费阶段时间比较长，抑制性反应比较大；逐渐温饱后，每次摄取食物时间慢慢变短，抑制性反应逐渐变小。periLCVGLUT2神经元的抑制性反应能够伴随小鼠内在饥饿或口渴程度变化，很大程度上追踪小鼠的进食或饮水时间的长短（每次饭量大小）。
PeriLCVGLUT2神经元的抑制性反应显著促进了基础代谢需求之外的饮食享乐行为
periLCVGLUT2神经元位于饥饿环路和口渴环路的共同下游，被饥饿或口渴状态所调节，但它的功能输出并不依赖于饥饿或口渴状态。譬如，即使在小鼠处于温饱状态下进食，periLCVGLUT2神经元也会产生抑制性反应；在温饱状态下，诱使小鼠去喝不含任何热量的代糖水，进一步抑制periLCVGLUT2神经元也能够引起代糖水的可口性迁移，显著增加其摄取量。
在当代社会，我们所吃的食物和所喝的饮料与我们的祖辈相比都产生了非常大的变化。如今的食物和饮料都已经经过高度工业化处理，被设计、加工成在口感、味觉上极度诱人的成品。很多时候，我们吃已经不单是为了饱腹，更多的时候是单纯为了追求饮食享乐行为（hedonic-eating）中带来的快感。想想看，有多少次你去吃去喝是因为无法抵制食物或饮料的美味？这种行为慢慢发展到现在已经逐渐成为肥胖、糖尿病等一系列健康问题的主要原因。通过对periLCVGLUT2神经元功能的揭密，我们希望能更多地了解饮食享乐行为的大脑作用机制，为将来更细致地研究这类行为奠定基础，也为将来可能的肥胖或糖尿病治疗提供新的思路。
（Picture by Julia Kuhl）
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.07.031
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