原核和真核生物基因组中大片段DNA的定向整合拥有广阔的应用前景。理想的定向整合系统不应被DNA片段大小限制，可一步到位实现高特异性的定向整合，整合位点可控，且整合过程不依赖于DNA双链断裂（DSBs）和同源重组系统（HR）。但目前细菌中的定向整合系统存在诸多不足，如效率偏低且缺乏有效的筛选标记物，可整合的片段大小有限，需要多载体协作且难以实现多位点同时整合。2019年，麻省理工学院Broad研究所的张锋实验室和美国哥伦比亚大学的Samuel H. Sternberg实验室分别发现了新的CRISPR转座酶系统，新系统可在向导RNA的引导下实现大片段DNA在细菌基因组中的定向整合（详见BioArt报道：专家点评Science Nature长文| 当CRISPR遇上转座子——实现位点特异性DNA片段的高效、特异插入）【1,2】。这一系列研究为定向整合系统的开发开辟了新的方向。
2020年11月23日，来自美国哥伦比亚大学的Samuel H. Sternberg实验室在Nature Biotechnology发表题为CRISPR RNA-guided integrases for high-efficiency, multiplexed bacterial genome engineering的论文。文章在2019年研究的基础上，对CRISPR转座酶系统进行优化和改造，获得的新系统INTEGRATE在细菌中可实现大片段DNA（可达10kb）的多位点定向整合。新系统具有极高的特异性且整合效率可达100%，因此无需额外的标记物进行筛选。此外，新系统在多种生物医学相关及工程相关的细菌中均有良好的整合效果，为原核生物的大片段DNA定向整合提供了更多可能。
2019年研究者采用的是三质粒系统在大肠杆菌中表达霍乱弧菌来源的CRISPR转座酶用于大片段DNA的定向整合。为简化流程并提高整合效率，研究者将关键元件有效组合，构建出INTEGRATE单质粒系统pSPIN，该系统使用单一启动子同时驱动向导RNA和多顺反子mRNA以表达关键蛋白和向导RNA。系统中还携带有迷你转座子（mini-Tn）以提供模板DNA用于定向整合（图1）。此外，pSPIN系统中启动子和模板DNA均可按需替换。
图1 霍乱弧菌来源的CRISPR转座酶系统基本原理（a）及INTEGRATE单质粒系统pSPIN的构建（b）
研究者证实，pSPIN系统在大肠杆菌中的定向整合效率超过90%且特异性很高。此外，转座子所携DNA片段的整合方向有明显的偏好性（转座子右侧靠近靶位点，即T-RL方向）。研究还发现，pSPIN系统中的启动子活性与整合效率呈正相关；与传统的37℃相比，室温条件下pSPIN系统有更高活性，且无论启动子活性高低，其整合效率和特异性均接近100%。此外，30℃条件下，pSPIN系统对1-10kb DNA片段的整合效率均可达到100%；而传统的三质粒系统只对<1kb的片段有较强的整合能力。研究者还将迷你转座子中的模板DNA替换为CRISPR转座酶的关键元件从而获得自整合系统pSPAIN，这一系统同样可实现100%的整合效率。
微生物工程研究中常需要用到多位点整合/敲除以构建功能更加复杂的工程菌。已知部分转座子如Tn7和类Tn7转座子具有转座排他性，即转座子整合区域常会排斥同类转座子的继续整合。作为类Tn7转座子家族的成员，霍乱弧菌来源的CRISPR转座酶同样具有转座排他性：整合位点附近5kb范围内的再次整合效率不足20%，不过在1Mbp之外，转座排他性消失。这表明，基因组中不同位点相距较远时，多位点同时整合并不困难。
要在细菌基因组的多个位点实现不同DNA片段的整合，单一的CRISPR转座酶系统很难保证特异性：已整合的DNA片段很可能会被重新转座整合至新的位点。为避免这种非特异性的发生，研究者尝试将不同来源的CRISPR转座酶系统联用以实现多位点不同片段的整合。除霍乱弧菌来源的CRISPR转座酶系统（VchINT）外，研究者还开发出贺氏伪枝藻来源的CRISPR转座酶系统（ShoINT），结果发现两系统联用可有效避免已整合DNA片段的重新转座和整合，大大提高了多位点不同片段整合的特异性。不过后续分析指出，与VchINT系统在目标位点整合的高特异性不同，ShoINT系统及类似的ShCAST系统有很高的脱靶风险，其在目标位点的整合比例仅有5%-50%。因此双系统联用依然有待进一步的改进。
除不同DNA片段的多位点整合外，同一DNA片段在细菌基因组中不同位点的同时整合也有重要的应用价值。研究者利用pSPIN系统和同时表达多种向导RNA的CRISPR阵列（CRISPR arrays），在细菌基因组中成功实现了多位点的同时整合并保证了整合的特异性。此外，研究者还将pSPIN系统与Cre-LoxP系统联用，成功实现了细菌基因组大片段的精准敲除。最后，研究者还在其它革兰氏阴性菌如产酸克雷伯氏杆菌及恶臭假单胞菌中证实了pSPIN系统的有效性。而通过位点选择和向导RNA的合理设计，pSPIN系统可在微生物群中实现特定菌种基因组的定向整合。
总体而言，本研究通过改造优化CRISPR转座酶系统，构建出了更为有效的定向整合工具INTEGRATE。新工具可快速实现大片段DNA在细菌基因组中多个位点的高效定向整合，有望成为微生物工程研究的利器。此外，新工具还可与其它工具如Cre-LoxP重组酶联用，从而在微生物研究中实现更复杂的基因编辑操作。当然，新的定向整合工具依然有不尽如人意之处，但其潜力依然值得期待。
原文链接
https://doi.org/10.1038/s41587-020-00745-y
参考文献
1. Klompe, S. E., Vo, P. L. H., Halpin-Healy, T. S. & Sternberg, S. H. Transposon-encoded CRISPR–Cas systems direct RNA-guided DNA integration. Nature 571, 219–225 (2019)
2. Strecker, J. et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science 365, 48–53 (2019)
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