文献分享——2014-在白血病患者中识别Pre-leukaemic HSCs

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文献分享——2014-在白血病患者中识别Pre-leukaemic HSCs

内容目录

前言关于作者背景知识克隆性造血相关内容白血病细胞相关内容NPM1基因PART1-非白血病细胞中DNMT3A突变的检测PART2-DNMT3A突变的HSCs仍可多系分化PART3-Pre-leukaemic HSCs可以耐受化疗PART4-Pre-leukaemic HSCs的克隆扩增讨论后记

前言

今天回过头来看之前看过的一篇文章，发现有的居然已经忘了一大半了，又得从头来看，真的比较费时间。所以，干脆一次辛苦，方便以后了，把主要的内容整理成笔记好了。

这次的文章是以色列威茨曼研究所的Shlush在2014年发表在Nature上的一篇研究：

论文标题：Identification of pre-leukaemic haematopoietic stemcellsinacuteleukaemia  

论文地址：https://www.nature.com/articles/nature13038

关于作者

这里有2个共一作者：Liran I. Shlush  和 Sasan Zandi，通讯作者是John Dick。

其中关于Shlush，我们都相对比较熟悉了，目前在威茨曼研究所。Zandi和Shlush一样，过去都是在John Dick Lab里做研究，现在也都毕业了。

放一个他们lab的网站，有兴趣的话自己去看看吧：

John Dick Lab：http://www.jdstemcellresearch.ca/

背景知识

克隆性造血相关内容

• 通过比较确诊AML和那些复发转移的患者样本，发现复发转移个体中的主要致病克隆和初诊时的克隆不相同，而是一些初诊时的小克隆。

• 初诊时的小克隆是日后疾病复发的根源

• 只有一小部分在AML原始细胞中存在的突变，可以在AML患者体内分离的HSC中找到。但是这些携带这些突变的HSC是可以正常向下分化的（其实也就是所谓的克隆性造血现象）。

白血病细胞相关内容

• AML中blast细胞的免疫表型：CD33+ CD45^dim

CD33是髓系细胞分化抗原，分子量为67KD，主要分布在髓系血细胞，特别是在分化的早期阶段。CD33在90%以上的急性髓系白血病患者都有表达。

这里要注意：CD33是可以在髓系血细胞表达的，如果想要表示AML中blast细胞，则还要加上CD45^dim

NPM1基因

NPM1基因位于染色体5q35，其编码的核磷蛋白具有多种重要的功能，如阻碍核仁蛋白的聚集，调节核糖体蛋白的装配以及这些蛋白在核与质之间的转运，启动中心体的折叠，具有分子伴侣作用，并可通过多种信号通路调节细胞增殖和凋亡。NPM1 基因突变在 AML 的发生和发展中起到重要的作用。

NPM1突变常发生于12号外显子，目前报道的有40多种不同的突变类型, 其中以A型突变最常见，约占70%-80%，表现为在第960-961位核苷酸之间插入TCTG。

尽管NPM1突变的类型不一，但均属于移码突变，导致核定位信号异常，从而使核磷蛋白由核内易位于胞质，该异常定位不但可影响蛋白质的正常功能，同时对某些肿瘤抑制基因ARF、P53 的正常通路及功能也产生一定的影响。

NPM1基因突变的发生率在FAB各亚型中亦具有异质性，见于除M3外的各亚型，在M4和M5中发生率较高。

NPM1基因突变是AML预后相对较好的判断指标。这可能与NPM1突变患者对化疗药物较敏感有关。研究发现在AML中，核转录因子NF-KB的活化是白血病细胞对化疗药物产生耐药性的主要原因，在NPM1突变的白血病细胞中，核磷蛋白由核内易位于胞质，与胞浆中的NF-KB蛋白相互作用，导致NF-KB被分解，活性降低，从而减弱NF-KB与DNA的结合能力，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

注意：当NPM1基因突变后，可以直接写成NPM1c

PART1-非白血病细胞中DNMT3A突变的检测

1. 使用深度靶向测序技术，对12个初诊AML患者的外周血DNA进行靶向测序，主要针对的靶基因有103个：

ABL1	ADAR	ADARB2	ASMTL	ASXL1	ATM	BCOR
BCORL1	BRAF	CBL	IL3RA	CD44	CDH23	CDKN2A
CDKN2B	CEBPA	CHD2	CNOT3	CREBBP	CRLF2	CSF1R
CSMD3	DDX3X	DNMT3A	DNMT3B	EBF1	ECT2L	EED
EGR2	EP300	EZH2	FBXW7	FLT3	GATA1	GATA2
GATA3	GLI1	GLI2	HELLS	HNRNPA1	HNRNPR	HRAS
HYDIN	IDH1	IDH2	IKZF1	IL7R	JAK1	JAK2
JAK3	KIT	KLHL6	KRAS	LPHN3	LRP1B	MECOM
MED12	MLH1	MLL	MPL	MSH2	MSH6	MUC2
MUC4	MYD88	NF1	NOTCH1	NPM1	NRAS	NXF1
PAX5	PCLO	PDGFRA	PDGFRB	PHF6	PIK3CA	PIM1
POT1	PTEN	PTPN11	RELN	RIMS2	ROR1	RUNX1
SEMG2	SF3B1	SI	SIRPA	SLC4A10	SMC3	SMO
SRSF2	SUZ12	SYK	TBL1XR1	TET2	TP53	TP53INP1
TTN	U2AF1	UMODL1	WT1	XPO1

主要针对CD33+的AML细胞和作为正常对照的T细胞进行测序：

• 4/12人有DNMT3A突变（9，10，11，12）

• 3/4人中正常T细胞内也可以找到突变（9，11，12）

• 在AML细胞中的DNMT3A突变VAF值较高，而正常T细胞中的DNMT3A突变VAF值较低

1. 为了看一看在AML患者中DNMT3A突变的情况，作者又找来一批样本——71个确诊为AML的患者，取初诊时患者体内正常遗传学的血细胞进行一代sanger测序：

• 17/71人有DNMT3A突变，突变率约24%

• 15/17人有NPM1c突变，且这2个突变的VAF大致相同

1. 找到这些样本后，对这17个人做ddPCR（定量分析）检测VAF值，结果如上图：

• 在CD33+的AML细胞中，DNMT3A和NPM1c突变的VAF非常相似。

• 在正常T细胞中，12/17人有DNMT3A突变，而NPM1c检测不到。

1. 又对其中2个样本检测了FLT3-ITD：

可以看到其中：在CD33+的AML细胞中可以发现有FLT3-ITD的存在，而在正常T细胞中基本上没有，在第2个患者中的MLP细胞中有发现。

由此作者推断说，突变发生有一定的顺序：

• 早期先有DNMT3A突变

• 而后出现NPM1c和FLT3-ITD

这样推断的话，其实也还算是有逻辑性的吧。

PART2-DNMT3A突变的HSCs仍可多系分化

为了探索DNMT3A突变细胞起源，因为目前认为DNMT3A先在正常细胞中出现，慢慢发展到AML细胞中，所以于是对11个DNMT3A突变/NPM1c的AML个体中正常细胞（CD33-）进行测序。

同时取了3个时间点的样本——初诊、缓解和复发。

1. 关于流式分选策略：

CD33^- CD34⁺ CD45^dim CD38^- ：

• MLP：CD45RA⁺

• HSC：CD90⁺ CD45RA^-

• MPP：CD90^- CD45RA^-

CD33^- CD34⁺ CD45^dim CD38⁺ CD7^- CD10^- ：

• CMP：CD45RA^- CD135⁺

• MEP：CD45RA^- CD135^-

• GMP：CD45RA⁺ CD135⁺

2. 作者对上述分选出来的AML患者体内正常HSPCs细胞和AML中blast细胞（CD33+ CD45^dim）进行ddPCR对DNMT3A和NPM1c做定量检测：

• 在所有AML患者的CD33⁺ blast细胞中，都发现了有DNMT3A突变和NPM1c。

• 没有NPM1c，而只有DNMT3A突变的HSPCs和成熟细胞中VAF变化较大。

2. 上面的图a和下图b都是一个比较典型的患者数据——no.11号患者：

从图a中可以得到的结论有（细胞数量差异）：

• 在不同时间点下细胞数组成差异较大，处于发病状态下时，CD33^- CD34⁺ CD45^dim 细胞数减少，HSC细胞数减少。

• 如果把从初诊→缓解→复发整个过程看作一个时间序列，那么：

• 细胞数一直增加的有：MLP、GMP

• 细胞数一直减少的有：MPP、CMP、MEP

从图b中可以得到的结论有（克隆大小差异）：

• 在初诊时，NPM1c克隆相对较小，只有GMP和Blast细胞中存在。在复发转移时，NPM1c克隆则在成熟和不成熟细胞中均有表达，且GMP中NPM1c克隆长大了。

• 在缓解期间，NPM1c被全部清除。只有DNMT3A突变的存在。说明DNMT3A突变克隆不是AML致病克隆。

• 不同时间点下：在HSC/MPP细胞中，仅带有DNMT3A突变，而没有NPM1c突变。可能NPM1c并不是来自HSC中，而是从下游的祖细胞而来。

• 复发的Blast细胞中DNMT3A的VAF变小，可能是因为一旦发病后，DNMT3A就不再是主要的克隆，而慢慢减小。

1. 下面对11个个体中的突变情况进行分析（不过文中没有具体说明这个样本的时间点，但是根据b图可以看出这个样本应该是在初诊时采集的）：

• 不成熟的HSPCs（如HSC、MPP、CMP、MEP、MLP和GMP）都可以检测到DNMT3A突变，而成熟细胞（如T、B和NK细胞）中很多没有DNMT3A突变。这一点的话和疾病相关吧，因为AML就是分化阻滞嘛，即使不成熟细胞中带有突变，在向下分化过程中肯定会有阻滞在某个阶段，然后成熟细胞中就带有较少的突变。

  这里作者说这个证据可以说明DNMT3A突变可以促进AML中NPM1c的发生？？有点疑惑？？

• 有3个人的数据——10、16和14，他们在HSC/MPP时没有DNMT3A突变，而到了CMP时就有了DNMT3A突变，有2种解释：1）因为HSC/MPP时VAF比较低，检测技术测不到。2）可能这个突变是在HSC/MPP→CMP过程中获得的。

• 但是我发现有个患者非常奇怪——28号。HSC/MPP时就存在DNMT3A突变，到了CMP时却没有了？？到了MEP后又出现了，而且还是DNMT3A突变和NPM1c共存？？好像这个现象不局限于28号，在57、35、16、36、14中都有这个现象。

  有想法的同学欢迎来讨论。

PART3-Pre-leukaemic HSCs可以耐受化疗

1. 对下图有个详细的分析：

• 与初诊时相比，在缓解和复发时，DNMT3A突变的VAF值略高或基本一致。

• 初诊和复发时的CD33+的blast细胞会同时携带DNMT3A突变和NPM1c突变。而缓解期的CD33+细胞只有DNMT3A突变，说明这些细胞不是AML细胞，而是仅仅携带有DNMT3A突变的干祖细胞（具有向下分化的能力）

• 在复发的样本中，大多细胞类型都具有2个突变，而只有HSC和MPP细胞只带有DNMT3A突变。说明HSC/MPP细胞并不是真正的AML细胞，在HSC/MPP→CMP/MLP过程中可能获得新的突变，出现pre-leukaemic HSCs细胞。

1. no.57患者生存时间较长，所以可以通过观察这个样本，比较早期缓解（3个月）和晚期缓解（36个月）时DNMT3A突变的情况：

• 可以看到相比于初诊，在缓解期随着时间的发展，DNMT3A的VAF值在大部分细胞中都是逐渐增大的，除了MEP、NK和T细胞基本不变。

1. 一些部分CD33+细胞，在缓解晚期（36个月）会出现类似初诊时同时携带DNMT3A突变和NPM1c的克隆，这说明：

• 要么是初诊时的造血克隆重新生长起来

• 要么是pre-leukaemic HSCs中新获得了NPM1c突变

小结：

因为在缓解和复发过程中，DNMT3A突变一直存在，所以认为Pre-leukaemic可以耐受化疗。

PART4-Pre-leukaemic HSCs的克隆扩增

为了检验DNMT3A突变的HSC是否有功能上的改变，在重建时是否有优势，作者进行了移植实验。

1. 实验样本：

• 11号患者（HSC/MPP中DNMT3A的VAF=30%）和55号患者（HSC/MPP中DNMT3A的VAF=20%）中的外周血单个核细胞

• 极限稀释LDA移植到免疫缺陷小鼠股骨内

• 在移植后第8和16周流式分析检测股骨内的植入物细胞组成

• 白血病细胞植入物定义为：CD45^dim CD33⁺

• 非白血病细胞植入物的话是一个混合物，认为既有淋系（CD19+B细胞），也有髓系细胞（CD33+）

其实这里我是有点疑问的，为什么只CD33这个来分析，非常矛盾，我们一般认为CD33是白血病细胞，正常髓系细胞的话可以用其他的marker吧？？

2. 对于no.11患者：

• 在35只小鼠中有24个长出了非白血病细胞植入物，由此推断干细胞的数目为每7.3*10⁵ 个细胞里有一个HSC。

1. no.11患者初诊和复发样本移植到小鼠16周时的数据结果：

• 初诊时：有较多的CD19淋系细胞，而CD33的髓系细胞和白血病细胞相对少

• 复发时：全是CD33的髓系细胞和白血病细胞，而缺乏CD19淋系细胞

说明与初诊时相比，复发时LSC数目更多。

4. 又对于no.11患者比较不同植入物的组成以及VAF情况：

• 仅有DNMT3A突变的小鼠有9/12只，平均VAF=57%

• 同时有DNMT3A突变和NPM1c的有2只，其中12号的植入物中CD33细胞比例较高

• 只有一个植入物中超过50%的都是CD33+细胞（12号小鼠），植入物中DNMT3A和NPM1c的突变VAF都相对较高（是Blast细胞）。

1. 又做了一个动力学实验，分别检测初诊时外周血样本，植入小鼠8周、16周后的植入物VAF：

关于这个图如何看：

图中第一列2个点分别是HSC和MPP中VAF的值

第二、三列中每个点代表一个小鼠中植入物的VAF值

可以得到的结论：随着时间的进展，DNMT3A突变的VAF越来越高。

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个人觉得以上描述非常的混乱，所以我就简单写下我自己的理解：

通过图b，我们可以看到12号小鼠中，植入物数目是白血病blast细胞为主，而且突变信息验证了这一点。而3号小鼠中，植入物数目中白血病blast细胞相对于其他较多，但是突变信息中证实这些都是正常的细胞。

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6. 上面的数据表明：

• HSC/MPP中发生DNMT3A突变可以向下继续分化。所以认为这样的细胞就是所谓的pre-leukaemic HSCs

• DNMT3A突变可以带给pre-leukaemic HSCs一定的造血重建优势。

• 小鼠移植模型说明，当pre-leukaemic HSCs数目远远高于LSC时，会主要产生非白血病细胞植入物。

6. 接下来作者用自己手上有的264历史临床AML样本移植到小鼠中的数据，总结了下移植物的细胞组成情况：

• 37%没有植入物

• 40%是白血病植入物

• 23%是非白血病植入物

于是作者又找到了手上有的历史数据——264个样本中有25个患者有一代sanger测序数据：

使用一代sanger测序方法对25个样本进行分析植入物的情况：

• 10/25有DNMT3A突变

• 12/25有IDH1/IDH2突变（其中3个同时有DNMT3A突变）

因为这是历史数据，所以没法确定到底这些植入物的来源是pre-leukaemic HSCs还是LSC。

8. 前面证明了pre-leukaemic HSCs中是携带有DNMT3A的，那么pre-leukaemic HSCs会不会携带有IDH1/2呢？如果能证明pre-leukaemic HSCs中携带有IDH1/2也许也能说明前面的问题，这些植入物来源于pre-leukaemic HSCs。于是用ddPCR对52，64，77号患者初诊时的样本流式分选细胞分别进行检测NPM1c和IDH2的突变VAF：

• 在所有Blast细胞中可以看到同时具有IDH2和NPM1c的存在，而在其他正常细胞中只有IDH2突变的存在。由此推断IDH2突变也是一个pre-leukaemic的状态。

讨论

1. 确定了在白血病的发生过程中，DNMT3A→NPM1c及FLT3突变的大致顺序。

2. 确定了在诊断时pre-leukaemic HSCs的存在，并且如果基于他们的数据，大概有25%的AML患者中有DNMT3A突变的存在。

3. 确定了DNMT3A突变的HSC/MPP有重建的优势。

4. 因为在缓解和复发过程中，DNMT3A突变一直存在，所以认为Pre-leukaemic可以耐受化疗，目前一些针对Pre-leukaemic突变的药物如IDH抑制剂之类的，也许可以在他们产生更强耐药性前彻底清除这些克隆。

后记

老实说，看Shlush的文章真的让人焦头烂额，可能还是自己没能达到那个层次吧，先这样吧😂