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作者：周元、蒋红钢、李克
来源：临床与实验病理学杂志
甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一。不同病理类型的甲状腺癌，生物学行为不同，且发病比较隐匿，故目前甲状腺癌的早期诊断仍比较困难。近年来随着分子生物学的发展，为甲状腺癌的早期诊断及合理治疗提供了有利帮助，越来越多的研究者也逐渐关注该领域。甲状腺癌的分子标志物较多，该文从甲状腺癌DNA、RNA及蛋白组学的相关标志物等方面进行综述。
甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，病理类型主要包括甲状腺乳头状癌（papillary thyroid cancer，PTC）、甲状腺滤泡状癌（follicular thyroid cancer，FTC）、甲状腺髓样癌（medullarythyroid cancer，MTC）、甲状腺未分化癌（anaplasticthyroid cancer，ATC）。目前，甲状腺细针穿刺活检术（fineneedle aspirationbiopsy，FNAB）被认为是鉴别良恶性结节的最精确检查。研究表明，行FNAB后经细胞病理学检查，其中5%为恶性，60%～70%为良性，10%～30%为不确定或可疑恶性，对这些不确定或可疑恶性病例进行术后病理检查，发现仅20%～25%为甲状腺癌，故有75%～80%的患者接受不必要的手术。因此，如何正确处理FNAB无法鉴别的病例，是目前临床医师面临的困难。随着分子生物学技术的发展，应用分子标志物对甲状腺癌进行鉴别诊断，能显著提高早期诊断水平，对甲状腺癌的诊断、治疗及预后分析有重要的临床意义。甲状腺癌的分子标志物较多，其研究主要基于外周血或FNAB后可获得DNA、RNA和蛋白组织。DNA相关标志物包括BRAF、Ras、RET/PTC和Pax-8/PPARγ等，RNA相关标志物则包括高迁移率族蛋白A2（high mobilitygroupA2，HMGA2）、端粒酶逆转录酶（humantelomerase reversetranscriptase，hTERT）、TFF3和miRNA等，蛋白组学主要是一些肿瘤标志物，如Galectin-3、HBME-1和CK19等。本文现就甲状腺癌的分子标志物研究进展进行综述。
1.DNA相关标志物
1.1 BRAF
BRAF基因位于染色体7q34，其参与Ras-RAF-有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinases，MAPK）、细胞外信号调节激酶-MAPK途径的信号转导。目前已发现40多种BRAF基因突变类型，主要为11、15外显子上第1799位核苷酸T→A的转换，即密码子600的突变。该突变导致BRAF激酶持续激活，并使其MAPK下游传导通路高表达，从而导致细胞过度增殖、分化，最终导致甲状腺细胞的恶性转化。众多文献报道，BRAF突变在PTC中的发生率较高，在良性结节中几乎不存在，因此认为BRAF突变对甲状腺癌是特异性较高的诊断标志之一。该基因的突变表达增高与PTC侵袭性、复发、淋巴结转移、远处转移及病死率增高密切相关。Xing等回顾性分析1978～2011年7个国家13个医疗中心的1849例PTC患者，中位随访时间33个月，对比BRAF突变阳性与阴性者总体病死率，分别为12.87‰和2.52‰，得出BRAF突变与患者的病死率增高密切相关。但国际上亦有不同的声音，韩国学者认为，BRAF突变对于韩国人群中PTC的侵袭性以及与疾病的预后无关。对于BRAF突变对疾病预后的影响，目前观点虽不一致，但BRAF突变被认为是影响甲状腺癌，特别是PTC发生、发展的重要遗传学事件，是潜在的预后因子。
针对BRAF基因早期干预、逆转BRAF突变，给未来治疗、提高预后和减少复发转移带来希望。目前多个针对BRAF突变及相关通路的分子靶向治疗已取得很好的效果。Sorafenib（BAY43-9006）是一种多激酶抑制剂，可抑制VEGFR、RET、BRAF等多种激酶，目前已被批准用于放射性碘治疗失败的分化型甲状腺癌。Baquero等提出通过Snail机制下调E-cadherin蛋白表达在甲状腺癌进展中起重要作用，基于该原理，PLX4720在控制肿瘤进展中有效。故分子靶向药物联合治疗有望成为改变甲状腺癌常规治疗方案。
1.2 Ras
Ras基因编码p21，可被生长因子、非受体酪氨酸激酶及G蛋白偶联受体激活参与信号传导，调控细胞增殖、分化和凋亡过程。当该基因发生突变时，可使Ras-p21长时间与GTP结合，使Ras-p21持续活化，从而使MAPK通路信号持续释放，最终导致甲状腺细胞癌变。研究认为，与甲状腺癌相关的突变主要是Ras点突变。人Ras基因突变热点主要有H-Ras、K-Ras和N-Ras共3种类型，多见于FTC，占FTC的40%～50%，其中以N-Ras突变最为常见，而在PTC中，约占10%。值得注意的是，Ras突变也可见于良性滤泡腺瘤或其他良性肿瘤。因此，其特异性相对较低，有学者认为，Ras突变的滤泡腺瘤可能是FTC癌前病变，或者是甲状腺癌发病的中间阶段。Ras基因突变在甲状腺癌发生的早期起作用，与甲状腺癌的组织分化有关，但对细胞恶性转化不起决定性作用。Gupta等回顾性分析63例FNAB检测Ras突变阳性的标本，约93%无明确细胞学诊断，并缺乏可疑的超声特征，组织学特征以滤泡型癌为主，淋巴结及远处转移并不常见，但双侧癌发生率高。可见，对于细胞学检测未能明确的患者，Ras基因检测对肿瘤的诊断有很大帮助。故提出对于行FNAB检测Ras突变阳性的患者可考虑行甲状腺全切术，而对于是否行预防性淋巴结清扫尚不明确。
1.3 RET/PTC
RET基因定位于10号染色体，属于编码跨膜的酪氨酸蛋白酶受体，是目前发现的相对特异的甲状腺癌基因之一。RET/PTC重排是PTC中较为常见的基因改变，占10%～40%。重排主要发生于RET酪氨酸激酶受体基因的3'端与多种非相关基因的5'端之间，继而激活MAPK和磷脂酰肌醇3激酶通路。RET基因重排在甲状腺肿瘤生成中扮演重要角色，与人种、地域差异，特别是放射史等有重要意义。如切尔诺贝利事故中射线的暴露，造成儿童和青少年PTC例数增加。研究发现，RET基因突变与遗传性MTC相关疾病（如多发性内分泌腺瘤病2A型、多发性内分泌腺瘤病2B型、家族性MTC等）关系密切。Salehian等提出RET基因突变筛查的重要性，因为该基因的存在或缺失影响治疗的策略，如对于预防性甲状腺切除术时机的选择以及手术切除的范围等。故早期可通过家系筛查，提前对RET突变基因携带者进行临床干预，减少发病机率，同时对于家系中非突变基因携带者也减轻心理负担，减少重复肿瘤相关检测的费用。
1.4 Pax-8/PPARγ
Pax-8/PPARγ基因重组，好发于FTC。但Chia等发现，FTC中Pax-8/PPARγ阳性率仅有11.1%。近期Mochizuki等发现，日本FTC患者中Pax-8/PPARγ阳性率为4%，远低于其他国家学者29%～63%的阳性率。统计数据的差异，可能与人群种族及地区差异有关。即便如此，该融合基因作为分子遗传标记应用于特定地区FTC的诊断和治疗仍有广阔的前景。Pax-8/PPARγ基因重组发生与第2、3条染色体易位t（2;3）（q13;p25）导致Pax-8基因与PPARγ基因融合，可引起PPARγ蛋白过表达，从而抑制细胞分化凋亡，促进肿瘤血管形成，导致上皮细胞过度增生形成肿瘤。该基因重组的甲状腺癌一般多见于年轻人，且肿瘤体积小，呈实性或局灶性生长，常伴血管浸润，可能与肿瘤的侵袭、转移及进展相关。
2.RNA相关标志物
2.1 HMGA2
HMGA2属于非组蛋白的染色质相关蛋白，本身无转录活性，通过与染色质结合后改变染色质构象调节其他基因的转录。HMGA2在正常组织中低表达或不表达，而在胚胎期以及恶性肿瘤组织中的表达明显上调。Jin等利用RT-PCR技术对120例标本进行检测，其中64例甲状腺恶性肿瘤，56例甲状腺良性病变，HMGA2在甲状腺恶性肿瘤中的表达均明显高于良性病变，区分良恶性甲状腺肿瘤的敏感度和特异度分别为90.2%和97.1%。因此，HMGA2是区别甲状腺良恶性肿瘤的重要标志物之一。
2.2 hTERT
端粒酶属于核糖核蛋白酶，能以自身RNA为模版，延长端粒，确保DNA的连续复制，其激活、表达与细胞的增殖密切相关。大多数恶性肿瘤中端粒酶的活性明显增加，其活性对于甲状腺良恶性具有良好的鉴别作用。hTERT是端粒酶的催化单位，其在永生细胞及癌细胞中高表达，被认为与肿瘤的发生、发展相关。hTERT的表达作为甲状腺恶性肿瘤的潜在标志物，且敏感性高于端粒酶的活性检测。Sugishita等报道显示hTERT在FTC中阳性率明显高于甲状腺滤泡状腺瘤。研究表明hTERT在甲状腺癌中高表达，可能是一个特异性较高的甲状腺癌生物标志物，有利于对良恶性甲状腺肿瘤的鉴别诊断。
2.3 TFF3
TFF3又称肠三叶因子，为三叶肽家族中一员，主要在大肠和小肠杯状细胞中表达。Patel等提示TFF3是甲状腺滤泡性肿瘤中区分滤泡性腺瘤与滤泡型PTC、FTC、PTC的标记，TFF3表达成为诊断FTC的可信标志物。
2.4 miRNA
miRNAs是一类短序列、非编码的RNA，长19～25碱基对，可作为基因表达的负调控因子。大量报道显示，目前有多种miRNAs已被证实在PTC中表达上调。Yu等对106例PTC患者、99例良性结节患者及44例正常成人采用Solexa测序技术和定量PCR技术对甲状腺组织和血清中miRNA进行检测，发现相对于良性结节和正常成人，PTC患者血清中Let-7e、miR-151-5p和miR-222的表达明显增高。miRNA表达及BRAF突变、肿瘤大小、有无外侵、淋巴结转移和肿瘤分期之间存在较强的相关性。Liu等在126个PTC样本中发现248个miRNAs和3631个基因表达，miR-206对应目标基因MET，miR-299-3p对应目标基因ITGAV，miR-101对应目标基因ITGA3，miR-103对应目标基因ITGA2，miR-222对应目标基因KIT和AXIN2，miR-15a对应目标基因AXIN2和FOXO1，miR-221对应目标基因KIT，结合对应目标基因的功能，进一步阐明miRNAs在PTC中的致癌作用。提示miRNA是PTC的潜在诊断及预后标志物，为将来基于miRNA的肿瘤治疗提供基础。另外，有文献报道在FTC中miR-885-5p呈高表达，在MTC中miR-10a和miR-375呈高表达。因此，miRNA在甲状腺癌的诊断和治疗中可发挥重要作用。同时，LncRNA的分析也越来越受到重视，其参与基因组印记、染色质修饰、转录激活干扰、核内运输等多种重要的调控过程。失调的LncRNA通过调节DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重构，并作为miRNA的前体在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。研究表明与甲状腺肿瘤密切相关的LncRNA有AK023948基因、甲状腺乳头状癌易感候选基因3（papillarythyroid carcinoma susceptibility candidate3，PTCSC3）。有关LncRNA在甲状腺肿瘤中的研究正处于起步阶段，其是否能成为早期诊断的分子标志物、预测预后及靶向治疗的有效靶点等有关问题，有待进一步分析得出结论。
3.蛋白组学相关标志物
3.1 半乳糖凝集素-3（Galectin-3）
Calectin-3是凝集素蛋白家族的一员，是一种与β-半乳糖苷具有高度亲和力的糖类结合蛋白，有多种生物学特性，包括细胞生长调控、细胞黏附、炎性介质反应、细胞凋亡等。近年研究发现其与肿瘤的发生、恶化和恶性转移有关，且被认为是区分甲状腺良恶性肿瘤最有价值的分子标志物之一。Calectin-3在甲状腺FTC和PTC中高表达，而在ATC或MTC中不表达或弱表达。Manivannan等对22例甲状腺滤泡增生性组织中Calectin-3表达进行检测，其中滤泡状腺瘤12例，FTC 3例，滤泡变异型PTC 7例，Galectin-3在后二者阳性，在良性病灶中阴性。所以Galectin-3可鉴别滤泡性结节的良恶性。Makki等通过ELISA法分别检测PTC患者及良性结节患者的血清Galectin-3水平，两组患者的平均值分别为7.07、6.6ng/ml，二者差异无显著性。表明虽然Galectin-3在肿瘤组织中高表达，但在血清检测良恶性肿瘤差异无显著性，不能区分良恶性，尚有待于进一步分析。
3.2 HBME-1
HBME-1是间皮细胞微绒毛表面特异性标志物，是间皮瘤相关抗体，在肿瘤血管的形成、生长及转移等方面发挥重要作用。多项研究显示HBME-1在分化型甲状腺癌中高表达，在ATC和良性病变中为阴性或部分表达。Paunovic等对242例存档的甲状腺组织标本进行免疫组化检测TPO、Galectin-3、CK19、HBME-1，4种标志物表达有助于PTC的诊断，敏感度为66.5%～82.2%，鉴别嗜酸性腺瘤及癌缺乏敏感性及特异性，Galectin-3和HBME-1各自在鉴别滤泡状腺癌和腺瘤中起重要作用，相比而言HBME-1的敏感性及准确性更高。联合应用有助于提高敏感度，HBME-1和TPO联合检测在鉴别滤泡状腺瘤及滤泡型PTC的敏感度达92.6%，在鉴别良恶性甲状腺癌中达89.1%，故HBME-1是鉴别良恶性病变敏感而准确的标志物，同时联合TPO检测有利于提高诊断甲状腺癌的准确性。多项研究表明，HBME-1与其他肿瘤标志物联合应用，更有助于PTC的鉴别诊断。
3.3 CK19
细胞角蛋白来源于局部上皮细胞，为形成表皮细胞的角质蛋白，其中CK19存在于各种上皮和正常上皮来源的肿瘤中，是一种低分子量的细胞角蛋白。Calangiu等分析结果显示，CK19在FTC及PTC的表达明显强于甲状腺良性病变，故在甲状腺恶性肿瘤的诊断和鉴别中CK19具有一定的参考意义。deMatos等对66篇关于CK19、Galectin-3及HBME-1在分化型甲状腺癌组织中表达的论文进行Meta分析，通过免疫组化检测，CK19敏感性及特异性分别为81%、73%，Galectin-3敏感性及特异性分别为82%、81%，HBME-1敏感性及特异性分别为77%、83%，三者联合的敏感性及特异性分别为85%、97%。表明联合三种分子标志物对与良恶性肿瘤鉴别的敏感性及特异性均有提高，但仍存在假阴性率及假阳性率，故需要不断探索其他标志物进一步巩固诊断的准确性。
4.其他分子标志物
除上述的分子标志物以外，其他的如Maspin、Neu、met、C-myc、N-myc等癌基因，PETN、p53、p27、p16等抑癌基因，VEGF、MMP、B-catenin、p-JNK、TPO等相关的分子标志物也值得关注。已经发现的与甲状腺癌相关的分子标志物众多，但目前尚未发现针对甲状腺癌完全特异性的标志物。
5.总结
综上所述，特异性的分子标志物对于揭示甲状腺癌的发病机制、早期诊断甲状腺结节的良恶性、决定治疗方案、监测复发情况和预测预后以及基因治疗，均有十分重要的意义。目前尚未有一种某一病理类型诊断依据的特异且敏感的标志物，因此，有待更多的相关分析筛选高特异性的标志物，对FNAB活检组织进行多个特异性分子标志的基因谱联合检测，必将对甲状腺疾病的病理诊断、治疗及预后评价起指导意义，为早期甲状腺癌的诊断提供依据。
参考文献（略）
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夏成青、刘正智、于励民、程慧敏、丁华野、陈培辉、病理学界、小艾公仔
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