在临床诊断实验室中，对疑似遗传疾病患者做基因检测，大家的落脚点，往往在“变异”上。
什么是变异呢？“变异”即个体和群体之间的差异。做法是将个体的序列，与人类公共参考基因组的序列进行比对，寻找到的mismatch，即错配就是变异Variant，和参考基因组匹配的标为Reference,一般不会单独去分析。
Reference是否就不用去关注呢
有一篇文章作者提到（在此特别感谢高勇博士和谭灏文博士提供的文献和见解），有一些reference alleles具有临床价值，人们往往会忽视这类位点，尤其是homozygous reference alleles更是需要重视。通过引入表型注释，那些与疾病相对风险增加相关的alleles，应始终被描述为alternative alleles。
那么，他为什么要这么提
在基因检测分析时，往往要面对变异在对照人群或普通人群中的携带频率，来帮助评估该变异的潜在致病性。通过大规模人群数据库比如ExAC, gnomAD等的搜索，如果某个变异在某地区，比如东亚普通人群的频率是0.01，显著高于该地区某个疾病的发病率（比如0.00001），则该变异很可能不是导致此疾病的变异。
在查阅人群数据库时，会发现许多变异位点的频率很特殊，表现为reference的频率低于同一位置的alternate的等位基因频率。举个例子，某个位点，有两种碱基T和C。T为ref，C为alt。但是如果去数C和T，发现T只有23，C有10540. Ref T被称之为“minor reference alleles“。
这类位点有多少？作者以ExAC数据库为基础，发现最新的ExAC版本包含26,537个变异的reference allele频率小于0.5（minor reference alleles）。 这些变异中约1％（2763个变异）是罕见变异（AF <0.01, rare="" reference="">
ExAC的数据是基于 GRCh37/hg19的结果，所以这个数字需要再去订正：当参考基因组从GRCh37转换到38时，有1214 个已知的variants修订为reference。
比如rs2109135，在GRCh37里面是chrX:12939928T>C，体现C为variant. 到了GRCh38，标识为chrX:12921809 C>T，C被修订为reference。
OK。你会说，那我就注意
1 既然GRCh37留下坑，升级会修复这种问题，所以以后尽量用GRCh38。
2 在1的前提下，如果再遇到minor/rare reference alleles，即一旦ref的等位频率占了少数，那样MAF指的不是alt的频率而是ref的频率，需要记得数字倒转，以免张冠李戴，把MAF给算成了reference的频率。
但仅仅考虑到这些是不够的。因为只是做了alternate的AF的正确计算，如果不注意，反而会因为这一步计算导致信息丢失。
因为这类位点的AF值都比较大，很容易一开始，在人群频率筛选中被过滤掉。所以留下来进行深入分析的可能性反而不大了。
比如作者通过Clinvar注释，挑选与致病，可能致病，危险因子等关键词的位点，发现从ExAC数据库中提取的含minor reference alleles的SNP， 有很多和疾病表型相关。
PMC5769444, Table 1部分
这些变异在人群数据库中的allele frequency普遍大于0.5，超过疾病发生率的常规阈值，在疾病研究中，如果在测序样本中出现这些位点，很容易在分析的初期就过滤掉了。
我们不能忽视这类位点
和表型相关的并不是alternate allele, 而是reference allele.
这里以血栓相关的几个SNP为例：
最经典的例子是Factor V的变异rs6025， c.1601G>A (p.Arg534Gln)，在以HG19为参考的基因组中，allele A是reference allele，也是致病变异。拥有的这种突变，使得Factor V不能与抗凝血蛋白正常结合，导致高凝状态，即患者很容易形成血栓。这个变异是欧洲人中最常见的遗传性高凝状态（易患凝血）。它以荷兰城市莱顿命名，1994年由R. Bertina教授等人首次发现（PMID 8164741）。
在人类参考基因组的GRCh38版本中，allele G属于reference, A更正为alternate, 从而解决了minor reference alleles是致病的问题，因此，患者的AA基因型可以被更加容易的识别。然而另外的几个变异，即使更新了人类基因组版本到最新，仍然是reference allele与疾病表型相关。
比如尿激酶型纤溶酶原激活物(PLAU) 基因中的变异10:75673101 T / C (rs2227564)， allele frequency在gnomAD为0.7525：
这个变异与冠状动脉疾病患者的侧支循环相关, 侧支循环不良患者 (Rentrop 0-1; n = 547) 所携带的基因型TT，其频率高于良侧枝循环 (Rentrop 2-3; n = 129;P = 020)。变异 rs2227564 的reference T是minor reference allele, 在侧支循环不良患者中比较常见(P =006)（PMID:24952395）。
比如有人通过研究NOS3 基因 rs1799983 多态性与老年人脑卒中后痴呆的相关性（PMID:20691505）发现，纯合TT基因型, 而不是 GT 或 GG 基因型，是一个发展成为痴呆的重要因素。与 GG 基因型相比, TT 基因型增加了痴呆的风险;风险比为3.14 (95% 置信区间, 1.64-5. 99; p = 0.001)。
以上列举的这些变异，并不会因为参考基因组从GRCh37到38的更新而改变其reference,即使目前很多人默认使用GRCh38作为参考，但是还有很多研究人员的分析流程，或者富集试剂盒采用老版本的参考基因组，尤其是面对大批量样本的时候，要保证前后参照的统一性，更改数据库势必需要花费额外的成本。要想使得参考基因组都换作最新的，是需要一定时间来过渡的。
而且，大部分的功能相关的minor reference alleles即使出现了参考基因组的更新， 到了新的基因组版本中还是minor reference alleles（PMC4416239）。
除了精力、成本、数据库一致性，对于经典人类基因组版本，还是最新的参考基因组，分析的时候仍然面临这个问题：如何寻找和疾病表型相关的reference allele.
其实并不好检测，因为常规的变异流程是寻找“Variants”的，如果这种reference alleles是纯合的，那么分析工具不会观察到这些位点与reference有任何差异；如果是杂合的，那么会在过滤的时候往往又会被当成allele frequency大于预定义的阈值而被过滤掉。
为什么reference alleles会和疾病相关？
人类基因组变异学会（HGVS）序列命名标准中，推荐的 reference序列是“a genomic reference sequencebased on a recent genome build”，即基于最近基因组构建的基因组的参考序列。reference等位基因使用“=”符号报告为“无变化”。但是，这些规则基于使用代表“正常”状态的reference序列的假设。
而人参考基因组的序列是从主要来自欧洲的匿名个体的DNA集合中获得的，参与者的临床和表型信息未知。尽管在研究期间他们可能是健康的，但他们中的一些也可能是疾病风险等位基因的携带者。
目前的现状是
临床相关的reference地位比较尴尬：
ACMG指南也并未明确要求研究者评估或报告reference的位点。迄今为止，在高通量基因测序实验中，没有明确的鉴定reference变异的建议。
所以，这些具有临床 相关性的位点具有reference allele，不太可能会出现在基因测序报告里面。
然而，忽视对纯合致病性 reference的分析，造成的后果是，将导致不准确的风险确定和诊断，尤其是当在标准变异识别中看到“variant“即和参考序列不一致的信息时，导致过早的结论。
对于这些位点，应该如何处理呢？
如果将reference也作为变异来看，
多样本： 可以使用 reference-freeSNP detection策略，即测序多样本之间直接进行基因型的比较，放弃从公共数据库下载的人类基因组序列，来克服识别不了的 reference型变异的限制（PMC4083407）。
单样本：可以换另外一个作者安利的软件RAREVATOR（PMC4416239），仅用于评估罕见的变异，基于GATK的非常经典的Unified genotyper算法。
经典 SNP 和 InDel 识别和 RAREVATOR 的变异识别方案。图 a 和 b经典胚系和体细胞变异识别方案。图c 和 d 是 RAREVATOR 的胚系和体细胞变异识别方案。RAREVATOR 利用 GATK Unified Genotyper来识别所有的Rare Reference Alleles位点, 并检测含有reference allele 的胚系和体细胞变异 (c 和 d)。
如果我们的眼界，仅仅是对参考基因组进行修饰，那么会使得变异的注释和共享变得尤其困难，因为需要增加额外的工作量来对不同的参照系的VCF执行标准化操作。
怎么样让问题变得简单？有针对性的识别是一种非常灵活的策略：可以利用针对所研究的具体问题来定制panel,比如基于具体的基因，或者基于人群的频率。
基于人群频率：minor reference alleles往来自于人群的特有的一些allele，如果用基于群体频率的panel来定义变异，那么等数据库内容更新的时候，panel 也会得到更新。而且，对于homozygous reference的置信度，可以利用测序的质量，读段的深度，基因型质量等来估计。
基于具体的基因：可以研究候选基因中的变异，或者与表型具有生物学相关性的基因。过滤时可以利用氨基酸的保守型信息：前人已经证明，非祖先次等位基因往往具有功能性（PMC3071924）。 非致病性alternative alleles倾向于提供保守氨基酸，而 reference（疾病相关）等位基因倾向于与近缘物种不同的氨基酸。
也就是说，对于这些位点，要和其他的变异区别对待，这样可以一定程度上减少工作量，用来分析和更新会更加方便。
人类基因组的更新又需要注意什么问题
到目前为止，发现与疾病相关的遗传变异，可以说是人类基因组的最大的功劳。 在定义什么是reference的时候，建议考虑到临床效用，比如通过引入表型注释，那些与疾病相对风险增加相关的alleles，应始终被描述为alternative alleles。
在人类基因组中，一些复杂区域仍然难以作为所有人群的reference。 寻找定义最佳 reference allele的共识，将极大地帮助改进对更新的人类基因组的minor reference alleles校正。
关于什么是reference, 还应该考虑到多个层面的证据：
例如，有人发现，疾病相关的allele多为次等位和衍生（PMC3017004）；尽管如此，有人认为allele frequencies应该更多的去考虑人口历史和血统（doi:10.4172/2469-9853.S1-008）；从进化的角度看，一个major ancestral allele，或者说在祖先种群中具有更高频率的allele将是reference的最好的选择。比如有很多在非洲发生的突变，其频率通过非非洲人的定向选择而上升，而非洲人则保持低水平。 因此，以祖先基因组作为基准被认为是重要的。
总结
纯合 reference变异的鉴定和报告可具有临床价值。
在这些位点中，纯合的alternative变异倾向于代表非致病性等位基因，通常被忽视的纯合 reference等位基因可能具有直接的临床意义。
这些变异应该通过修改现有识别策略来寻找和评估，特别是在单样本外显子组和全基因组的分析。
作为一种长期解决方案，在以后的人类基因组更新时，需要对人类基因组中的“reference等位基因”状态进行后果定义。
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