【导读】
2010年，广州疾病预防控制中心、 中山大学、南方医科大学抽取广州某市场70份样本，湿仓储存普洱茶存在黄曲霉毒素和呕吐毒素不同程度污染，本次调查所抽取的普洱茶样品中，均被检出伏马毒素和T-2毒素， 90%呕吐毒素污染水平超标，11.43%黄曲霉毒素污染超出标准限值，应引起广泛重视!
【作者单位】：
广州市疾病预防控制中心
中山大学公共卫生学院
南方医科大学生物技术学院
广州市医药卫生科技项目(2008-YB-223)
【摘要】
一.目的： 为了解广州某茶叶市场湿仓储存普洱茶中真菌毒素的污染情况，对所抽取的70份普洱茶样本中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、伏马毒素(fumonisin B1，FB1)、呕吐毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇，deoxynivalenol，DON)和T-2毒素的浓度水平进行检测，旨在为制定有关普洱茶叶安全卫生管理规范和相关的卫生标准提供数据资料。
二.方法： 随机抽取广州某茶叶市场湿仓储存普洱茶70份，破碎、浸提、过滤后采用免疫亲和层析净化-高效液相色谱法检测AFB1，ELISA试剂盒检测FB1、DON和T-2毒素的污染情况。
三.结果： 本次调查所采70份普洱茶样品中， 呕吐毒素污染水平超出标准规定限值(1 mg/kg)的有 63例(90％)，黄曲霉毒素AFB1污染水平超出标准规定限值(5 μg/kg)的有8例(11.43%)， 伏马毒素FB1和T-2毒素污染水平均未超出标准规定限值(分别为1 mg/kg和100 μg/kg)。
结论：本调查结果提示广州市该茶叶市场中的湿仓储存普洱茶存在不同程度的黄曲霉毒素（AFB1）及呕吐毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON)污染情况，而FB1及T-2毒素虽未超出标准规定的限值，但在样品中均可检出，应引起广泛重视。
真菌毒素(mycotoxin)是一些真菌(主要为曲霉属、青霉属及镰孢属)在生长过程中产生的生物毒素，目前已知的真菌毒素有200余种，按主要产毒菌种可将其分为曲霉菌毒素(如黄曲霉毒素、棕曲霉素等)，青霉菌毒素(如展青霉素、桔青毒素等)，镰刀菌毒素(如脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等)及其它类(如孢子毒)等4类。真菌毒素可通过污染谷物及动物性食物(如牛奶、肉和蛋)进入食物链从而危及人类健康。真菌毒素毒性谱较广，如抑制免疫系统、造血系统、导致神经内分泌紊乱、及肝肾损伤等。有时其毒性作用表现为地方病，更为严重的是，部分真菌毒素已被证实具有致癌、致畸和致突变作用。
中国是茶叶的生产、出口和消费大国，其中普洱茶系里的湿仓储存茶叶由于其生产加工的环境适于真菌毒素生长而经常可见霉变现象，因而存在真菌毒素污染的可能。基于此，本研究选择几种常见的真菌毒素，进行湿仓储存普洱茶样本中黄曲霉毒素B1(aflatoxins B1, AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)、伏马毒素(fumonisin B1, FB1)和T-2毒素的污染情况的检测，从而为加强普洱茶卫生管理、制定相关卫生标准等提供基础资料。
1.1 主要试剂
AFB1标准品由英国AXXORA公司提供，FB1检测试剂盒、DON检测试剂盒、T-2毒素检测试剂盒均由北京安易世纪贸易有限公司提供。试剂盒组成：包被羊抗免抗体IgG的微孔板、阴性对照物、毒素标准品、毒素HRP酶标记物、兔抗毒素抗体、底物、终止液等。
1.2 样品
1.2.1 样品采集 于2009年7～8月份随机抽取广州某茶叶市场共70份湿仓储藏普洱茶样品。
1.2.2 样品前处理 参照试剂盒说明书进行处理，主要步骤为：取茶样，用料理机粉碎后过20目筛，置一有盖容器中，取相应比例萃取液(分别为70%甲醇液或纯水)，剧烈震荡2～3 min后静置5 min，取上清用直径为0.45 μm的一次性滤器过滤，滤液进行检测。每个样品取3等份，分别进行前处理和检测并将加权平均作为该样品的生物毒素浓度值。
1.3 方法
根据国家标准[1]，采用免疫亲和层析净化-高效液相色谱法(immunoaffinity chromatography purification-high performance liquid chromatography， IAC-HPLC)检测。主要检测步骤为：试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有AFB1特异抗体的免疫亲和层析净化并用PBST去除免疫亲和柱上的杂质，用甲醇洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。
1.3.2 FB1、DON和T-2毒素检测 参照ELISA检测试剂盒所提供的方法。主要检测步骤为：取过滤液或将其进行适当比例稀释后，每一个ELISA反应板孔中加入50 μl样本溶液、50 μl酶结合物和50 μl抗毒素抗体,同时设立标准品系列和对照反应孔，混匀后于室温下震荡孵育10 min，再用清洗液洗板5次后加入反应底物100 μl,置室温震荡孵育5 min后用终止液中止 ELISA反应，在450 nm波长下测定D(450)值，根据标准品系列浓度以及相关的D(450)值,绘出标准工作曲线，利用该标准曲线求出相应的浓度值。
2 结 果
2.1 样品中分析结果显示，各样品均可检出AFB1，参照国家标准，70份样品中AFB1浓度水平超过5 μg/kg的有8例，占11.43%(见表1)。超标的8份样本中，有3例超出标准规定限值1.5倍以上。
2.2 样品中FB1水平分析结果见表2，可见，样品中FB1水平均较低，参照瑞典对玉米及其相关产品的限量值(1 mg/kg)评价，各样本FB1浓度水平均未超标。
2.3 样品中DON水平,ELISA法分析结果见表3，可见，样品中DON浓度水平较高，根据标准《GB 2761-2005 食品中真菌毒素限量》所规定的标准限值(1 mg/kg)进行评价，超出标准规定限值的有 63例，占所研究样本量的90％。其中超出标准规定限值2.5倍以上的样本例数为16例，详见表3。
2.4 样品中T-2毒素浓度水平ELISA法分析结果见表4，可见样品中T-2毒素水平均较低，参照前苏联所规定的限量值(100 μg/kg)评价，所研究样本T-2毒素浓度水平均未超标。
讨论：
黄曲霉毒素是人类及多数物种的强诱变剂和肝致癌物[2]，因此1993年世界卫生组织将其认定为Ⅰ类致癌物。黄曲霉毒素是曲霉和寄生曲霉代谢产物,为一类稠环类固醇结构的化合物，已证实有17种衍生物,其中最为重要的包括B1、B2、G1、G2、M1等5种，在天然污染的食品中以AFB1最为多见, 毒性和致癌性亦最强, 然后依次是: M1>G1> B2> G2。毒物代谢动力学结果提示AFB1极易经胃肠道和腹膜吸收[3]，因此各国食品卫生标准对植物性产品中AFB1含量有严格的规定，如我国对玉米等粮谷类产品及其制品中AFB1安全卫生限量标准为5
伏马毒素(fumonisins)是1989年发现的、由串珠镰刀菌等产生的一种新型、强毒性生物毒素，目前已知有7种衍生物,其毒性机制主要为抑制神经酰胺酶的活性、干扰神经鞘氨醇脂生物合成等，此外，FB1诱导肾细胞产生活性氧簇是其毒性机制之一[5]，FB1引起的氧化损伤可能是其诱导细胞损伤和DNA损伤的潜在机制[6]。文献表明，FB1可引起肝损伤和心血管机能异常[7]，导致马发生白脑软化症，猪发生肺水肿综合症[8]，并被怀疑可诱发人类的食道癌等疾病。伏马毒素主要存在于玉米及其制品中，韩国、南非等国家对玉米及其产品中FB1的限量为7.9 mg/kg，瑞典规定人类食物中FB1限量为1 mg/kg[9]。
DON (又名呕吐毒素)是F.镰刀菌霉的二级代谢产物，常与其它真菌毒素共存。该毒素为剧毒，大鼠经口LD50为7.3 mg/kg。人畜摄入被DON污染的食物饲料会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状,严重时危及造血系统甚至致死。研究表明， DON可直接导致DNA损伤并诱发细胞凋亡[10]。我国国家标准《GB 2761-2005 食品中真菌毒素限量》中, 小麦及玉米中DON的限量为1 mg/kg。
T-2毒素及其代谢产物HT-2是由镰刀菌产生的具有热稳定性特点的真菌毒素，其毒性主要为免疫和血液毒性，如食物中毒性白细胞缺乏病 (alimentary toxic aleukia,ATA) 即被认为是霉变粮食中镰刀霉菌产生的T-2毒素引起的[11]，此外，虽未有定论但已广受关注的是T-2毒素可引起地方性大骨节病。2001年欧洲食品科学委员会提出T-2 + HT-2的联合摄入暂时允许量为0.06 μg/(kg·d)[12]。前苏联曾将谷物中T-2毒素的容许含量定为100 μg/kg[13]。
真菌(霉菌)较易在植物体上寄生，其代谢产物及毒性产物容易污染植物性产品而引起中毒。由于普洱茶在生产工艺、储存和运输过程中的特点，存在着被真菌或其毒素污染的潜在可能，而湿仓储存的普洱茶受霉菌污染的现象尤为突出。因此为了解湿仓储存普洱茶真菌毒素的污染情况，我们随机从广州某茶叶市场12家店共抽取了70份样本，对其进行了4种常见真菌毒素的检测。由于茶叶多直接冲泡饮用，因此取其浸提液进行检测。
检测的结果表明70份普洱茶样品中黄曲霉毒素B1和DON均存在一定程度的超标，且部分样品超出标准规定限值2倍以上。在超标样品中，有的样品只是黄曲霉毒素B1超标，有的样品只存在DON超标，也有部分样品同时存在两种毒素，且两种毒素浓度均超标，但统计学分析结果提示4种毒素污染不存在相关性。另一方面，尽管目前茶叶中对黄曲霉毒素B1的限量标准尚未制定，但由于黄曲霉毒素B1作为一种明确的人类致癌物及呕吐毒素被归类为剧毒物，因此需加强对这两种毒素污染的监测和控制管理乃至制定详细的限量标准。关于伏马毒素，目前国内外对其污染情况的关注多集中在玉米及其相关产品中，对其他植物性产品如茶叶还未提及。本课题结合目前食品卫生发展新动态，对普洱茶中的FB1进行了检测，参考部分国家对FB总量的限量标准(1 mg/kg)，所测FB1的总量虽均未超出标准，但考虑到伏马毒素的毒性作用，也应引起一定的关注和重视。关于T-2毒素污染水平的研究结果提示，茶叶中T-2毒素均未超过100 g/kg的限量标准且浓度较低，提示产生该毒素的真菌类在茶叶中不易生长或产毒量较低。
参考文献
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收稿日期： 2010-09-01； 修订日期：2010-12-01
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