大家好，今天给大家带来的是一篇比较简单(划掉经典)的研究外泌体中MicroRNA表达的文章，题目叫做“Increased Exosomal MicroRNA-21 and MicroRNA-146a Levels in the Cervicovaginal Lavage Specimens of Patients with Cervical Cancer”，即宫颈癌患者宫颈阴道灌洗液中外泌体MicroRNA-21和MicroRNA-146a水平增加，下面是必看的背景介绍~
背景介绍：
外泌体(exosome)内包含了蛋白质、mRNA、微小RNA( microRNA)、长链非编码RNA (lncRNA)、DNA、脂质等物质，研究发现外泌体在细胞间通讯、肿瘤免疫、肿瘤治疗、组织损伤修复、疾病诊断中具有重要的意义。
MicroRNA的表达谱对癌症的类型和来源以及疾病的进展具有高度的特异性，如果不使用侵入性的方法很难检测到MicroRNA的表达谱，加之异常组织（癌及癌前病变）的MicroRNA水平升高通常不足以引起循环MicroRNA水平的变化,所以MicroRNA在上皮衍生的癌症如宫颈癌，鼻咽癌，肺癌，胃癌，结肠癌等的检测中可能发挥作用；而
我们已经知道外泌体MicroRNA在肺癌及结直肠癌中可以作为特殊的生物标志物，那么推测在子宫颈癌中是否也可以发挥同样的作用呢？
话不多说，接下来我们就通过6组图来共同学习吧！
Fig1.
Fig1.我们首先确认了宫颈癌患者子宫颈阴道灌洗液标本中存在大量外泌体。
取45例宫颈癌患者、25例HPV阳性患者及32例HPV阴性的正常人标本进行检测。
图A：电子显微镜显示出外泌体的特征性球形和大小（40-100nm; 10个囊泡的大小）；图B、C表示灌洗液上清中未发现外泌体存在（CD63、CD9为外泌体膜标志物），而超速离心后发现外泌体存在；图D、E表示通过蛋白免疫印迹和ELISA发现CD9表达水平与分离自子宫颈阴道灌洗样本的外泌体之间存在剂量依赖性相关性。
Fig2.
Fig2.其次确定宫颈癌患者宫颈阴道灌洗标本中富含外泌体 microRNA-21。（CD9作为外泌体膜标志物）
HPV(-)、HPV(+)正常人与宫颈癌患者灌洗标本中 microRNA-21表达水平对比（图A为RT-qPCR；图B、C、D为ELISA方法），发现宫颈癌患者外泌体MicroRNA-21表达最高。
Fig3.
Fig3.同时宫颈癌患者宫颈阴道灌洗标本中也富含外泌体 microRNA-146a。
方法同Fig2.结果：发现三类人中宫颈癌患者外泌体MicroRNA-146a表达最高。
Fig4.
Fig4.我们发现可以通过钙离子载体刺激Hela细胞释放外泌体
电子显微镜观察到使用钙离子载体A23187刺激Hela细胞后外泌体量的增加。
图A：未使用A23187；图B：使用0.5 μmol/L的 A23187刺激; (C,D)使用1 μmol/L 的A23187刺激。
Fig5.
Fig5.进一步研究发现钙离子载体可以刺激Hela细胞释放外泌体Micro RNA
图A、B：不同浓度的A23187刺激Hela细胞1小时后细胞释放不同表达水平的Micro RNA；
图C、D：不同浓度的A23187刺激Hela细胞1小时后其细胞内Micro RNA水平增长无统计学意义；
图E：不同浓度的A23187刺激Hela细胞1小时后细胞释放不同表达水平的外泌体（以CD9作为膜标志物）；
图F:较高浓度的钙离子载体刺激可以降低Hela细胞活性。
Fig6.
Fig6.为了证明得到的外泌体MicroRNA-21确实是由钙离子载体刺激产生的，并在受体细胞中是功能性的，作者首先建模（图A、B），构建靶向Mrcro RNA的质粒（含荧光素酶）受体，使用钙离子载体刺激Hela细胞产生含Micro RNA的外泌体，将二者放在一起反应，其次观察荧光素酶的活性。
结论：发现MicroRNA-21可以降低荧光素酶的活性。
Conclusion:
本研究首次报道了子宫颈癌患者宫颈阴道灌洗标本中外泌体MicroRNAs水平升高，这意味着在非侵入性宫颈癌筛查中的潜在应用，已经证明，在风险人群中，宫颈癌的良好筛查方案可以大大降低大型人群宫颈癌发病率和死亡率。目前已有的巴氏涂片法和液基制片法及HPV DNA检测各有优缺点，仍然需要更高的灵敏度和特异性的更有希望的诊断方法。
作者推断宫颈癌相关的 MicroRNA-21和MicroRNA-146a 是由肿瘤细胞分泌并以外泌体形式分泌到宫颈阴道腔内，其外泌体中MicroRNAs表达水平的增高可能作为宫颈癌的一项筛查指标。
参考文献：
Increased Exosomal MicroRNA-21 and MicroRNA-146a Levels in the Cervicovaginal Lavage Specimens of Patients with Cervical Cancer；
authors：Jie Liu, Hong Sun,Xiaoli Wang,Qun Yu, Shuhong Li, Xiaoyan Yu, and Wenwen Gong；
Int J Mol Sci. 2014 Jan; 15(1): 758–773. Published online 2014 Jan
8. doi: 10.3390/ijms15010758
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