现代测序技术的出现能够对已培养的、更重要的是对未培养的微生物进行高通量基因组分析，大幅提高了鉴定和表征微生物的能力。然而，当前的测序技术对微生物分析仍存在几大挑战。例如，研究样品可能在实验室以外，或者研究环境位置偏远。传统庞大笨重的测序仪器不易装运，同时需要大量的IT基础设施和专业人员操作，使得这些技术难以用在偏远地区或移动环境中进行实地分析。在监测疾病爆发或在危及生命的感染性疾病中，需要快速获得准确的基因组信息来鉴定病原微生物，而大多数下一代测序（NGS）的仪器需要经过培训的工程师精确校准，因此难以用于快速部署。
由Oxford Nanopore公司研发的纳米孔长读长实时测序仪MinION，重量不足100g，体积小到可以放在口袋里。MinION利用笔记本电脑上的USB接口通电，支持实时碱基识别和分析，是一种适用于实地研究的独一无二的便携式设备。最近Oxford Nanopore还推出了MinIT测序分析仪，可以和MinION配套使用。MinIT有预先配置的MinION控制软件(MinKNOW)，可进行数据捕获和碱基识别。无需为MinION测序配备单独的笔记本电脑。
01
周期缩短
猩红热病原体
最近，中国疾控中心传染病预防控制所、传染病预防控制国家重点实验室张建中研究员课题组针对当前我国流行的重要细菌性传染病——猩红热的病原体A族链球菌（Group A streptococcus, GAS）[1]，利用Oxford Nanopore技术进行基因组完成图的测定。
课题组提取了自猩红热高发区分离的GAS菌株TJ11-001的基因组，利用纳米孔MinION测序仪在R9.4测序芯片上进行了测序。结果显示，Oxford Nanopore测序技术在10分钟内产生的reads数据即可即时获取GAS基因组中全部重要的耐药基因（红霉素耐药基因ermB、四环素耐药基因tetM等）、毒力基因（红疹毒素speC、链球菌超抗原ssa等），并确定了该菌株为emm12基因型。
单独用Oxford Nanopore的长reads在1小时内即可组装达到GAS基因组平均长度（1.85Mb），准确率达到99%以上。同时可获得包括长度为61kb的ICE-HKU937和长度为46kb的prophage HKU.vir等在内的全部移动元件序列信息，这些移动元件往往携带上述多种耐药基因和毒力基因在GAS不同血清型菌株间播散，可能是引起猩红热发病率上升的重要因素，对这些大片段基因组移动元件的监测对于我国乃至全球猩红热防控具有重要意义。
肠道病毒
肠道病毒（EV）是一种单链RNA病毒，每年可造成全球数百万人感染。感染引起的临床症状可从良性咽喉痛到更为严重的支气管炎和肺炎。PCR检测是常规鉴定具有临床价值的病毒最常用的方法。然而，在使用PCR时，病毒基因组中经常出现的点突变和重组事件有可能导致出现假阴性结果。
瑞士伯尔尼大学的Alban Ramette博士及其小组评估了使用纳米孔cDNA和直接RNA测序是否能从临床研究样本中获取完整的肠道病毒基因组[2]。使用来自培养的病毒cDNA样本，他们在测序运行开始的几分钟内就获得98.8％的序列一致性准确度。在使用nanopolish软件对序列进行处理后，精确度能提高到99.8％。此外，在像病原体鉴定这类时间要求严格的应用中，伯尔尼大学使用的无需逆转录或扩增的RNA直接测序样本制备法只耗时5.5个小时，相比cDNA方法需23个小时。
肠道微生物组是一个富含抗微生物药物耐药性基因的环境，对抗生素治疗反应呈显著影响。肠道耐药性基因组在确定抗生素治疗对共生菌影响方面也有着重要作用。然而，目前尚缺乏快速肠道耐药基因组图谱分析的有效方案。借助纳米孔测序技术，丹麦科学家Helm所在的研究小组进行了快速全面的抗生素抗药性分析。他们使用ICU患者的排泄物样品进行宏基因组DNA制库，并在测序6-48小时后鉴定出26个抗微生物药物耐药性相关基因，平均序列同源性为97.3％[3]。
结核分枝杆菌
对于结核分枝杆菌（TB）的鉴定，当前广泛使用的方法建立于实验室细菌培养基础上，常常需要耗时数周。在不经培养的情况下，使用PCR进行TB抗微生物药物耐药性分析仅可检测出最常见的耐药性相关突变。利用纳米孔技术，Votintseva等人进行了全基因组测序[4]。
该团队对培养的牛型结核分枝杆菌BCG菌株(BCG)，以及联合培养的阴性痰DNA和BCG DNA样品进行了研究。研究结果表明，在BCG鉴定和吡嗪酰胺耐药性检测中，从患者采样到获得结果所用时间为7.5小时。而从采样到得到结果的13.5小时内，可进行准确、全面的抗微生物药物耐药性分析。
埃博拉病毒
科学家们还尝试利用MinION的便携性进行实地检测和分析。来自英国伯明翰大学的科学家Josh Quick将MinION通过标准的航空行李带到了几内亚，监控在西非流行的埃博拉病毒。在那之前，由于缺乏本地的测序能力，以及无法把样品到远距离的测序中心，基因组监测一直处于零星状态。
Josh Quick的研究小组在到达后的两天内便将MinION用于实时基因组检测，证明了它在条件有限的地区也有可能实现病毒病原体实地检测和分析 [5]。在总共六个月的时间里，小组共分析了142个埃博拉病毒样品，鉴定出了塞拉利昂和几内亚之间的物种传播，并提供了可用的公共卫生数据。在关键资源（包括可靠的电力供应、实验室、服务器计算能力）通常严重受限的发展中国家，纳米孔测序技术有潜力从根本上改变临床和公共卫生环境中的传染病诊断。
02
超长读长
除了实地检测和实时分析，要真正理解微生物和病原体的多样性，当务之急还在于建立完整和充分表征的基因组。微生物基因组中存在重复区域和结构变异，它们对微生物的功能，如抗药性和毒力因子的发展和传播往往有着重要的作用。传统测序技术只能读取长度为150-300bp的短读长片段，致使基因组的组装通常都高度片段化，因而在解析大型结构变异，准确分析重复性基因组或进行相关物种基因组组装方面面临巨大的挑战。
与通常处理短DNA片段的传统测序平台相比，Oxford Nanopore研发的纳米孔测序技术可处理的DNA片段的长度只受限于通过纳米孔的DNA的长度。纳米孔测序现在已经能够做到常规处理数十万碱基的完整片段，并已经产生了超过2.3Mb的超长读长[6]。使用超长纳米孔读长，已经可以在单一读长中对整个病毒基因组进行测序，完全无需组装[2]。超长读长的优势还在于它可能跨越重复DNA和结构变异的整个区域，从而允许更完整、无空白的基因组组装。这就好比组装拼图：拼图的图片越大，拼起来就越容易。
除了便携式的MinION测序仪，Oxford Nanopore还推出了两款高通量台式测序仪GridIONX5和PromethION。这两款测序设备采用与MinION一样的核心技术，可以分别支持5到48个芯片的运行。每个芯片可以独立使用，根据实验需要选择使用的数量。
03
小福利
目前Oxford Nanopore正向广大的科研工作者们征集研究妙想的活动，并已经进入了公众投票的阶段，最终得票最高的5个科研妙想可以分别获得一个MinION测序仪启动套装和一个入门培训的名额。赶快点击“阅读原文”为你心中的最佳妙想投票，帮他们带走测序仪大奖吧！
End
参考资料：1）You Y, Davies MR, Protani M, McIntyreL, Walker MJ, Zhang J. Scarlet Fever Epidemic in China Caused by Streptococcuspyogenes Serotype M12: Epidemiologic and Molecular Analysis. EBioMedicine. 2018Feb;28:128-135.doi: 10.1016/j.ebiom.2018.01.010. Epub 2018 Jan 11.
2）Ramette, A. Applications of nanopore sequencing to wholegenome sequencing of human viruses in the clinical setting. [online] Availableat: <www.vimeo. com/252171562>
3）van der Helm, E. et al. Rapid resistome mapping usingnanopore sequencing. Nucleic Acids Res, doi:10.1093/nar/ gkw1328 (2017).
4）Votintseva, A. A. et al. Same-day diagnostic andsurveillance data for tuberculosis via whole genome sequencing of directrespiratory samples. J Clin Microbiol, doi:10.1128/JCM.02483- 16 (2017).
5）Quick, J. et al. Real-time, portable genome sequencingfor Ebola surveillance. Nature 530, 228–232, doi:10.1038/ nature16996 (2016).
6）Payne.A (2018) Whalewatching with BulkVis: A graphical viewer for Oxford Nanopore bulk fast5 files.doi:https://doi.org/10.1101/312256
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