天上有太阳，
夜晚照样黑暗，
还好地球是圆的。
花儿会凋谢，
就像时光，
可是春天总会来。
政治书上说，
任何事物都有两面，
正如黑和白。
如果药物会失效，
难道人类要坐以待毙？
……
我不谈辩证法，
我只想讲一讲，
PD-1抗体与PNGaseF的爱恨情仇。
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当身体发生感染时，感染附近区域可变红、肿和热。这种发炎过程有助于排除体内的受损细胞和病原体等有害刺激并开始愈合过程。但若炎症长期不消退则会损害周围的健康组织。为了限制这种损害，细胞会在其表面表达PD-L1蛋白（Programmed death-ligand 1，程序性死亡配体1）。当PD-L1蛋白跟T细胞表面的PD-1蛋白（programmed death 1，程序性死亡蛋白1）接触并发生反应时，此T细胞便会凋亡，则该区域不发炎。癌肿瘤的生长常与慢性炎症相关联。肿瘤细胞和正常细胞之间有许多相似之处，而且肿瘤细胞可在其表面表达很多种蛋白质，这都使抗癌药物发展更具挑战性。
通过调动自身的免疫系统来对抗肿瘤，是一种越来越流行的癌症治疗方法，称为肿瘤免疫治疗。这种做法是让自身适应并最终接管对抗肿瘤的过程，使患者更健康、经受的副作用更少。其中，PD-1和PD-L1抗体药物已成为这种新型治疗方法的支柱，因为它们大多数表达在肿瘤细胞的表面，而在正常的细胞中几乎不表达。这使它们成为很好的候选药物靶点，因为这样药物对健康细胞的伤害较少。
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人PD-1 抗体药物nivolumab
PD-1抗体的抗癌效果是前所未有的，一次次地在美国临床肿瘤年会上刮起黑色旋风。据权威期刊《新英格兰医学杂志》编委表述：PD-1抗体是过去30年里抗癌效果最好的。有分析认为，PD-1抗体的市场可能会达到350亿美元。临床实验也表明，跟其他免疫疗法相比，PD-1和PD-L1抗体药物能缩小更多种肿瘤和对更多患者有效。以前的免疫疗法反应率只有10%，而PD-1和PD-L1药物对25-40%的患者都有效，这些药物也显示较低的毒性水平。与那些使用其他标准癌症治疗方法的患者相比，使用这种药物的患者可以活得更长。
目前临床试验中已经包括多种针对PD-1通路阻断的单克隆抗体药物 。然而，不是所有患者都会对PD-1抗体有响应。目前来看，各疾病对PD-1抗体的响应率如下：黑色素瘤患者（17-40%）、肺癌（10-30%）、膀胱癌（25%）、卵巢癌（6-23%）、头颈癌（14-20%）、霍奇金淋巴瘤（87%）、肝癌（20%）、肾细胞癌（20%-30%）。
这到底是为什么呢？
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2017年5月10日，一篇发表在《科学转化医学》期刊上的论文《In vivo imaging reveals a tumor-associated macrophage–mediated resistance pathway in anti-PD-1 therapy》可以给我们答案：
那么多患者
对PD-1/L1抗体不响应，
是因为
巨噬细胞把PD-1/L1吃了！！！
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《科学转化医学》封面
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用事实说话
论文出自哈佛大学医学院附属麻省总医院的Mikael J. Pittet教授团队，他们首先给PD-1抗体加上黄色标记，再利用活体显微镜实时监测标记后的PD-1抗体在结肠癌小鼠模型中的动向。在将标记的PD-1抗体注射入结肠癌模型小鼠体内5分钟后，就发现肿瘤微环境内的T细胞上有了染色标记。最开始标记的PD-1抗体结合到肿瘤浸润T细胞周围而几分钟后在T细胞表明形成色块，之后这些色块都在肿瘤相关巨噬细胞内。
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小鼠活体成像前对抗体及各细胞的标记
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注射早期小鼠PD-1抗体从T细胞到巨噬细胞的转移过程
为了深入了解巨噬细胞吃掉PD-1抗体的过程，研究者首先提取了三种肿瘤模型中小鼠体内相关细胞，发现大部分的肿瘤相关巨噬细胞内都有PD-1抗体。数据线性回归分析发现，巨噬细胞吃掉抗体与巨噬细胞的数量无关：即使巨噬细胞的数量极低，也能将PD-1吃光，而且巨噬细胞不会主动与PD-1抗体结合。研究者随后在体外创建了一个由骨髓分离得到的巨噬细胞和T细胞共培养体系：首先将T细胞与标记的PD-1抗体共培养，然后与巨噬细胞共培养，结果显示标记后的PD-1抗体在数分钟内就从T细胞转移至巨噬细胞中，这不能仅仅归结为巨噬细胞的吞噬作用，因为在加入了吞噬抑制剂后，这一转移仍然很快就发生，并且巨噬细胞不会吞噬没有与T细胞结合的PD-1抗体。
既然肿瘤相关巨噬细胞并不与PD-1抗体结合，也不会在注射的早期吃掉PD-1抗体。因此研究者推测，PD-1抗体的转移是通过一种非抗原特异性机制。随后研究人员发现巨噬细胞表面存在Fcγ受体，这一受体与T细胞PD-1抗体复合物上Fc结构域相结合，介导PD-1抗体的吞噬。随后利用以流式细胞计监测的抗体转移实验证明了这一发现：T细胞首先与染色后的PD-1抗体共培养30分钟，然后与巨噬细胞一起培养 ，最后用流式细胞计分析，大量PD-1抗体在巨噬细胞内被测出。然而，如果在实验开始时加入Fcγ受体抑制剂，那么PD-1抗体就不会从T细胞转移到巨噬细胞。
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Fcγ受体抑制剂抑制巨噬细胞吞噬小鼠PD-1抗体
之后研究人员通过酶偶联免疫吸收剂实验，发现巨噬细胞与T细胞以及IgG2a抗体（与鼠PD-1抗体同源）共培养后， IgG2a抗体同样被巨噬细胞降解。由于Fc/FcγR与抗体的结合与抗体的Fc结构域上的多糖结构相关，研究人员分析了小鼠的PD-1抗体以及人类PD-1抗体，结果发现小鼠和人类PD-1抗体上主要糖的类型是相同的，因此他们推测小鼠体内Fcγ受体介导的抗体转移也会发生在人体内。随后他们在体外将人PD-1抗体nivolumab用AF647标记并与免疫 T细胞共培养，之后从人体血液单核细胞中分离出巨噬细胞，再将两者共培养3天，同样看到PD-1抗体转移到巨噬细胞，转移同样可以被Fcγ受体抑制剂抑制，证明了Fcγ受体也可以调节nivolumab在人体的摄取。
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小鼠和人PD-1抗体结构的比较示意图
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Fcγ受体调节nivolumab在人体的摄取
最重要的是，
研究人员也找到了
防止PD-1抗体被吞噬的方法！！！
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他们利用一种叫做PNGaseF的酶来除去小鼠PD-1抗体上的糖链，然后用AF647标记，发现除去糖之后的PD-1仍能与T细胞结合，却不会被巨噬细胞吃掉。而且Fcγ受体被抑制后PD-1抗体与T细胞结合的时间显著延长，并且Fcγ受体被阻断的所有小鼠结肠癌模型对PD-1抗体都产生了响应，所有小鼠肿瘤都被完全抑制。目前PD-1抗体单独使用的响应率仅30%左右,而小鼠体内PD-1抗体加Fcγ受体阻断剂却对所有小鼠产生响应，这一发现无疑对目前免疫治疗领域造成巨大影响，为免疫治疗不敏感癌症患者提供新的治疗方案，让癌症变得不再可怕。
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PNGaseF处理PD-1抗体前后巨噬细胞吞噬效果对比
更重要的是，功臣产品PNGaseF在AtaGenix的官网随时有售。点击链接即可直达：
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Final QC of PNGase F
参考文献：
1. http://stm.sciencemag.org/content/9/389/eaal3604
2. E.B. Garon, N. A. Rizvi, R. Hui, N. Leighl, A. S. Balmanoukian, J. P. Eder, A.Patnaik, C. Aggarwal, M. Gubens, L. Horn, E. Carcereny, M.-J. Ahn, E. Felip,J.-S. Lee, M. D. Hellmann, O. Hamid, J. W. Goldman, J.-C. Soria, M.Dolled-Filhart, R. Z. Rutledge, J. Zhang, J. K. Lunceford, R. Rangwala, G. M. Lubiniecki, C. Roach, K. Emancipator, L. Gandhi; KEYNOTE-001 Investigators, Pembrolizumab for the treatment of non–small-cell lung cancer. N. Engl. J. Med. 372, 2018–2028 (2015).
3. Arlauckas SP, Garris CS, Kohler RH, Kitaoka M, Cuccarese MF, et al. 2017. In vivo imaging reveals a tumor-associated macrophage–mediated resistance pathway in anti–PD-1 therapy. Science Translational Medicine 9
4. Baumeister S H, Freeman G J, Dranoff G, et al. Coinhibitory pathways in immunotherapy for cancer[J]. Annual review of immunology, 2016, 34: 539-573.
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