血培养需氧瓶报阳后应该怎么处理?每家实验室都有自己的流程。应该转种什么平板?涂片看到细菌却培养不出怎么办?假阳性怎么处理?本文给你答案。
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一、阳性培养物涂片与转种Smear and inoculation of positive culture
(一)涂片
(↑此图为配图非原书稿图片)
血培养仪报告阳性后,取出血培养瓶,记录报警时间及观察生长曲线,将培养瓶颠倒混匀,用75%酒精消毒血培养瓶内盖,待完全干燥后用1ml无菌注射器抽取0.2~0.3ml培养物滴在两张玻片上,一张进行革兰染色,另一张备用(做瑞氏染色或弱抗酸染色),自然干燥或烘片机烘干固定。
(二)镜检与转种 查见革兰阳性球菌取培养物转种血琼脂平板,查见革兰阴性杆菌取培养物转种血琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板,查见真菌菌丝,直接转种沙保罗、真菌显色平板,并将凃片结果及时报告临床(危急值报告)。
若查未见细菌,进行瑞氏染色并结合细菌生长曲线,确定是否假阳性(革兰染色与瑞氏染色均未见细菌可判为假阳性)
(三)结果解释:
1.若涂片查见革兰阴性杆菌,转种血琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板48h后不生长,疑似不严格厌氧菌,取培养物再转种厌氧血琼脂平板或普通血琼脂平板,置厌氧环境培养24h~48h观察生长情况;若厌氧环境不生长,可自制血琼脂平板重新转种。
2.若涂片查见革兰阳性球菌,转种血琼脂平板48h后不生长,疑似乏养菌。取培养物重新转种用金黄色葡萄球菌点种做卫星试验,若卫星试验阳性,进一步鉴定菌种;若仍不生长,疑似不严格厌氧菌(置厌氧环境培养),若再不生长可自制血琼脂平板重新转种。
3. 假阳性为血培养仪器报警后,培养物涂片镜检未查见细菌,采用瑞氏染色若仍未查见细菌,没有生长曲线。若确定假阳性后,还需转种血琼脂平板并将血培养瓶放回培养箱中继续培养24~48h后观察生长情况。若未见细菌生长,血琼脂平板还需延长培养7~14天(考虑有无支原体、分枝杆菌属、真菌、组织荚膜胞浆菌及巴尔通体等病原体的可能)。
4.假阴性为血培养仪器不报警,取培养物涂片查见细菌,转种血琼脂平板有细菌生长。
5.值得一提的是,血培养报阳后应该先涂片,根据涂片革兰染色结果选择转种相应的培养基。但是有些单位转种与涂片染色同时进行,往往造成培养基的浪费。因为涂片镜下见到革兰阳性球菌以及确定假阳性,只需转种血琼脂平板,无需转种其他两块平板(麦康凯平板和巧克力平板);查见真菌菌丝,直接转种沙保罗、真菌显色平板,不再转种三块平板(血琼脂平板、麦康凯平板和巧克力平板)。所以不推荐转种与涂片染色同时进行。
6.在临床上患者有感染症状,实验室检查感染指标,如降钙素原、C反应蛋白、白细胞等显示增高,但多套血培养无细菌生长,应考虑生长缓慢的特殊病原体,将没有报警的血培养瓶取培养物涂片(排除假阴性),若涂片未找到细菌,将血培养瓶放回培养箱延长培养,再与临床沟通重新送血培养作延长培养7~14天。
7.自制血琼脂平板方法:从未使用过的血培养瓶中取20ml液体,琼脂0.24克混匀,高压灭菌121℃15分钟,冷却50℃后加入1ml羊血或人血,倾注平板。
8.质谱测定:血培养阳性肉汤通过分离胶离心富集细菌后进行直接质谱测定,可以明确病原体。具体操作见相关章节。
(三)血培养报阳处理流程(图3-)
注:“BAP”为血琼脂平板、“CAP”为巧克力琼脂平板、“Mac”为麦康凯琼脂平板
“+”为有细菌生长,“-”为无细菌生长
血培养阳性标本涂片手工操作仍不能缺少。涂片染色结果不仅为临床诊断提供有价值的信息,而且对微生物鉴定全过程起到导向作用。
二、阳性培养物涂片初步鉴别病原菌Preliminary identification of pathogens by smear of positive culture
革兰阳性球菌:如发现短链状、长链状、成双、成单等排列,拟考虑为链球菌属。见到矛头状排列、有荚膜的革兰阳性双球菌(有时呈单个、短链状)拟考虑为肺炎链球菌,这种细菌很容易误认为是革兰阳性杆菌,此时,不仅要注意细菌的单个形态,更要注意细菌的整体排列状态。镜下形态为革兰阳性球菌,葡萄状成堆、成双等短链排列,可能为葡萄球菌属。肠球菌呈链状排列,一般为3~5个一列。如发现革兰阳性、菌体为丝状、分枝菌,应考虑放线菌或诺卡菌。
革兰阴性球菌:如肾形成双排列时,疑似脑膜炎奈瑟菌。血培养一般比较少见,常见于脑膜炎奈瑟菌的感染,判断要结合脑脊液的培养结果。此类细菌在涂片中较肥大,一般为散在排列,需与不动杆菌相鉴别。
革兰阳性杆菌:革兰阳性杆菌形态分为大杆菌和小杆菌。如发现革兰阳性粗大杆菌,有芽孢,两端钝圆,应考虑枯草杆菌。如见到革兰阳性,菌体一端或两端粗大,呈棒状、不规则、栅栏状等排列,疑为棒杆菌。而小杆菌短小,疑似产单核李斯特菌,观察时要注意排列方式,易与肺炎链球菌相混淆。
革兰阴性杆菌:革兰阴性杆菌形态多样,有长杆菌、球杆菌以及弧形杆菌。肺炎克雷伯菌形态粗短,有时会有荚膜。铜绿假单胞菌形态细长。不动杆菌属和莫拉菌属呈革兰阴性球杆菌样,需与革兰阴性球菌相区别。如发现革兰阴性细小杆菌或者沙粒样成团簇状排列的细菌,则怀疑是布鲁氏菌、流感嗜血杆菌等。另外,有些破裂细胞碎片易被误认为是革兰阴性菌,但是革兰阴性小杆菌形态完整,二者要加以区别。
真菌:涂片染色为革兰阳性的酵母状,圆形或椭圆形,有时会出现较多的假菌丝,相互结交成团(偶尔会出现注射器抽吸时发生针头被堵塞的情况),可能为白念珠菌、新生隐球菌等其他真菌。
涂片革兰染色在多数情况下都能找到病原菌,但也有一些涂片很难发现病原菌,由于病原菌与破碎细胞碎片和(或)染液残渣混在一起,不易被发现。周庭银研究发现,可重新涂片作瑞氏染色,若有细菌镜下可见形态清楚、着紫色的细菌,完整的红细胞(图3-1),若瑞氏染色无细菌(图3- ),可以确定假阳性。但是瑞氏染色涂片不能辨别病原菌的革兰染色属性,可根据革兰染色背景判断是革兰阳性菌还是阴性菌。
血培养阳性培养物直接涂片(图3-)
(↑此图为配图非原书稿图片)
图3-血培养阳性培养物涂片各种形态
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