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编译：微科盟草重木雪，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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论文ID
实验设计
实验结果
LBP的得率为1.67%，碳水化合物含量为54.74±3.49%。BCA试剂盒测定蛋白质含量为16.30±0.88%。我们目前研究中使用的LBP主要由八种单糖组成，包括鼠李糖（6.93%）、阿拉伯糖（26.00%）、木糖（1.77%）、甘露糖（2.56%）、葡萄糖（19.31%）、半乳糖（19.80%）、葡萄糖醛酸（1.10%）和半乳糖醛酸（23.26%）（图1）。
我们建立D-半乳糖（D-gal）诱导的POI小鼠模型，探讨LBP对卵巢的改善作用。首先，我们使用Wright染色来确定小鼠的发情周期阶段（图2A）；然后，使用连续10天的单个折线图和统计直方图来分析每组小鼠的发情周期是否规律（图2B和C）。与对照组小鼠相比，D-gal组的发情周期受到干扰，具体表现为发情持续时间延长，发情后和发情间持续时间显著缩短（P<0.05）。低剂量LBP处理显著重建了正常的发情周期（P<0.001）（图2C）。生育能力测试显示，D-gal组的小鼠妊娠率（20%）低于对照组（60%）（图2D），后代总数（7）低于对照组（21）（图2E）。LBP高剂量组（60%）的妊娠率高于D-gal组（20%）。此外，LBP组获得的后代数量（17）高于D-gal组（7）。与对照组相比，D-gal小鼠血清FSH和LH水平显著升高（P<0.05），而雌二醇（E2）水平没有显著变化。LBP组小鼠的FSH和LH水平显著降低（P<0.05，P<0.001）（图2F–H）。卵巢切片H&E染色显示，D-gal组小鼠的总卵泡数、原始卵泡数、初级卵泡数、次级卵泡数、有腔卵泡数和黄体数显著减少（P<0.05，P<0.01），闭锁卵泡数和囊性卵泡数显著增加（P<0.05）。与模型组相比，LBP高剂量组的原始卵泡、初级卵泡和有腔卵泡数量增加，囊性卵泡数量减少（P<0.05，P<0.01）（图3）。这些结果表明，LBP可以调节POI小鼠的生殖激素水平，恢复卵巢储备和生育能力。
临床研究表明，POI患者肠道微生物群的结构失调，受损的肠道微生物群加速了卵巢功能的退化。因此，我们研究了LBP对POI小鼠的改善作用是否与肠道菌群有关。alpha多样性是微生物组成丰度和同质性的重要指标。结果表明，模型小鼠的Chao和Shannon指数与对照小鼠没有显著差异，这表明连续给予LBP 12周对模型小鼠肠道微生物群的α-多样性没有显著影响（图4A和B）。
基于OTU水平的PCA分析表明，每组小鼠的肠道微生物群组成分散较小。模型小鼠和对照组的肠道微生物群组成之间存在显著差异（P=0.033）（图4C），而LBP小鼠的肠道微生物群聚集区更接近对照组（P=0.001）（图4D）。结果显示，模型小鼠的肠道微生物群组成与对照组之间存在显著差异，而补充LBP能够部分恢复上述差异。
线性判别分析用于评估不同代谢物种对组内差异的影响，直方图的长度表示不同生物的影响程度。在对照组、D-gal组和LBP组中，我们共发现29个OTU与其他组显著不同（图4E）。乳杆菌科和Anaerovoracaceae以及乳杆菌属、Alloprevotella和Ileibacterium是对照组的优势微生物群。蓝藻门和放线菌门；Clostridia_UCG-014和Gastranaerophilales；Anaerofustaceae科、Eggerhelleae属、Anaerofustis属和Bilophila属是D-gal组的特征菌群。放线菌纲、双歧杆菌目、双歧杆菌科、双歧杆菌属和Blautia属在LBP组中富集。
为了进一步评估LBP对小鼠肠道微生物群组成的调节作用，我们门水平上比较了各组肠道微生物群的组成。如图4F所示，小鼠肠道微生物群主要由厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、Desulfobacterota和变形菌门组成。与对照组相比，D-gal组中厚壁菌门的相对丰度降低，拟杆菌门的相对丰度增加，而补充LBP进一步加剧了这一趋势。D-gal组放线菌、Cyanobacteriota和Gastranaerophilales的相对丰度较对照组显著增加（P<0.05），LBP显著逆转了这种情况（图5A–C）。在科水平上，模型组放线菌的相对丰度显著降低（图5D）。在属水平上（图4G），Clostridia_UCG-104、Eggerthellaceae、Bilophila、Anaerofustis和xylanophilum的相对丰度增加（图5E–I），而模型组中Faecalibaculum和Blutia的相对丰度显著降低（图5J和K）。LBP处理后，模型组小鼠中上述微生物群的丰度被调整回对照组。结果表明，LBP对肠道微生态有积极作用。
肠道菌群结构和组成的变化影响宿主的代谢功能。早期研究证实了代谢变化在评估卵母细胞质量和研究卵巢疾病方面的可靠性。因此，我们使用UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析了粪便代谢谱。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）评分图的结果表明，质量控制样品在正离子和负离子模式下都能很好地聚类（图S1†），表明该分析方法具有良好的稳定性和可靠性，可用于后续粪便代谢物的分析。如PLS-DA评分图所示（图6A和B），模型组和对照组小鼠明显分离，表明两组小鼠的代谢产物存在显著差异。LBP组和模型组是分开的，表明LBP补充剂可以调节D-gal诱导的粪便代谢产物的变化。为了验证模型的可靠性，我们进行了置换检验（n=200），结果显示，在正离子模式下，R2=0.84和Q2=-0.585，在负离子模式下R2=0.501和Q2=-0.616（图S2†）。R2的值大于0.5，Q2为负值，表明这两个模型没有过度拟合，可以反映样品中代谢物的真实变化。火山图显示，与对照组相比，模型小鼠粪便中有23种代谢物上调，25种代谢物下调（图6C），而补充LBP部分逆转了这些变化（图6D）。
我们使用在线人类代谢组数据库（HMDB）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库共鉴定了22种潜在的生物标志物（表S1†），热图被用来展示不同组之间差异代谢物的全局趋势（图6E）。与对照组相比，模型组有8种代谢产物减少，16种代谢产物增加，包括stearidonyl carnitine、guanidino succinic acid和tyramine glucuronide。与对照组相比，D-gal组的allylestrenol、5，6-二羟基前列腺素F1a、N-乙酰亮氨酸、L-精氨酸和二氢皮质醇显著增加，4-trimethylammoniobutanal、不对称二甲基精氨酸和PE（24:0/15:0）显著下调。补充LBP显著逆转了上述代谢物的变化（图7A–H）。差异代谢产物的进一步通路富集分析显示，与对照组相比，模型组的赖氨酸降解、类固醇激素合成、精氨酸生物合成以及戊糖和葡萄糖醛酸相互转化发生了显著变化（图7I），LBP显著调节精氨酸生物合成、甘油磷脂代谢和类固醇激素合成（图7J）。
多维数据的关联分析有助于我们系统地了解疾病和药物的机制。我们的结果表明，代谢物水平与特定肠道菌群之间存在显著的正相关和负相关（图S3†）。为了进一步查明补充LBP后，哪些肠道菌群对代谢产物的变化具有主导作用，我们使用Pearson相关性分析来探索肠道细菌组成与差异代谢产物之间的潜在关联。结果表明，LBP对代谢产物的调节作用与肠道微生物中的Faecalibaculum、Bilophila和Anaerofustis显著相关（图8）。总之，补充LBP后代谢产物的变化与肠道菌群Faecalibaculum、Bilophila和Anaerofustis的调节密切相关。
为了检验肠道微生物组和POI相关生化指标之间的关系，我们使用Pearson相关分析研究了这两个参数之间的相关性。Alloprevotella和Faecalibaculum与有腔卵泡呈正相关（P＜0.05，P＜0.01）。普雷沃氏菌科与闭锁卵泡呈极强的负相关（P＜0.05）。Blautia与原始卵泡呈正相关（P<0.01），与FSH呈负相关（P<0.05）。Anaerofustis、Eggerthellaceae和Bilophila与囊性卵泡呈强正相关（P<0.05、P<0.01和P<0.001），与初级卵泡呈负相关（P<0.05，P<0.01）（图9）。相关分析结果表明，Alloprevotella、Faecalibaculum、普雷沃氏菌科、Anaerofustis和Eggerthellaceae的相对丰度水平与POI相关指标的变化密切相关。这表明上述肠道菌群可能有助于POI的发生和恢复。
讨论
POI的主要临床治疗方法是激素替代疗法（HRT）。激素替代疗法被推荐用于治疗POI患者的血管运动症状和预防骨质疏松症。卵母细胞捐献（OD）被认为是POI患者不孕最合理的治疗选择。目前的研究结果表明，热量限制、抗氧化剂和自噬诱导剂可以显著延缓卵巢衰老。POI的治疗主要通过检测卵巢储备功能来评估，其常见指标包括月经周期和促卵泡激素水平。D-半乳糖诱导的衰老模型已被广泛用于研究POI的机制，并已揭示D-半乳糖诱发的颗粒细胞凋亡加速了卵泡闭锁和生育能力受损。在我们目前的研究中，我们发现LBP调节了POI小鼠紊乱的发情周期，并降低了LH和FSH水平。此外，LBP增加了POI小鼠的卵泡总数并提高了其生育能力。
研究表明，肠道微生物群通过改变肠道细菌及其代谢产物来影响内分泌代谢。我们的数据显示，在POI小鼠中，放线菌、Eggerthellaceae、Xylanophilum、Gastranaerophilales、Anaerofustis和Clostridia_UCG-104的相对丰度显著增加。临床研究表明，POI患者粪便中Eggerthellaceae的丰度显著增加。在小鼠灌胃后，Eggerthellaceae通过增加TGF-β水平来促进卵巢纤维化，而激素替代疗法逆转了Eggerthellaceae诱导的卵巢纤维化。我们发现LBP降低了小鼠体内Eggerthellaceae的粪便丰度。这表明Eggerthellaceae可能是治疗POI的潜在靶细菌。
临床研究表明，POI患者粪便中Faecalibaculum的丰度降低。Faecalibaculum是人类肠道中最重要的共生细菌之一，具有抗炎作用，可以保护消化系统免受肠道病原体的侵害。研究表明，Faecalibaculum通过抑制白色念珠菌的定植和致病性来减轻葡聚糖硫酸钠盐诱导的结肠炎。此外，Faecalibaculum衍生的微生物分子可以通过调节紧密连接蛋白的表达来恢复糖尿病小鼠的肠道屏障结构。在目前的研究中，我们还发现POI小鼠Faecalibaculum的相对丰度显著降低。结果表明，LBP提高了Faecalibaculum的丰度。这一观察结果表明，LBP可能通过增加Faecalibaculum而产生POI延缓作用。
代谢紊乱与肠道微生物组的组成和功能变化有关。在这里，我们使用非靶向代谢组学来揭示LBP对肠道微生物代谢的有益影响。5-雄烯二醇同时具有雌激素和雄激素活性，其水平呈年龄相关增加，也与更年期早期的雌二醇水平呈负相关。据推测，5-雄烯二醇在更年期早期雌激素缺乏中起到补偿作用。结果表明，POI小鼠体内5-雄烯二醇水平较高。这表明5-雄烯二醇可以作为POI的候选生物标志物。此外，POI小鼠的几种氨基酸代谢途径发生了改变，如赖氨酸降解、精氨酸生物合成和脯氨酸代谢。研究表明，口服精氨酸可以提高公山羊的生育能力。LBP调节5-雄烯二醇、N-乙酰亮氨酸和L-精氨酸的水平，这可能与其提高生育能力有关。
据报道，卵巢储备减少的患者卵泡液中二甲基精氨酸与精氨酸的比例降低。ADMA是一种内源性一氧化氮（NO）抑制剂。最近的研究表明，ADMA是一种新的血管功能障碍生物标志物。我们的研究表明，POI小鼠粪便中的不对称二甲基精氨酸（ADMA）与精氨酸的比例降低。据推测，POI患者和POI小鼠中ADMA含量的降低可能与血管功能异常有关。我们发现LBP处理增加了POI小鼠粪便中不对称二甲基精氨酸/精氨酸，这可能是其增加卵巢储备的重要途径。
结论
我们目前的研究强调，LBP显著增加了POI小鼠的卵泡总数。此外，LBP在调节紊乱的发情周期和提高生育能力方面也很有效。同时，LBP纠正了紊乱的肠道微生物群及其代谢衍生物。研究结果为LBP在女性卵巢健康中的应用提供了有益的支持。
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