胆碱对单抗产量和糖基化的影响

 摘要

迄今为止，还没有研究针对CHO细胞补料分批培养的培养基中胆碱的优化，本文首次报道到了培养基中最佳胆碱比例及其对CHO细胞补料分批培养中mAb浓度和mAb质量的影响。

一、 背景

单克隆抗体（mAb）和Fc融合蛋白已被广泛应用于临床治疗，已经成为自身免疫性疾病和肿瘤治疗的主流药物。由于mAb疗法通常需要长时间大剂量的服用，因此必须要生产大量的单克隆抗体才能满足临床研究和市场需求。为了解决这一难题，生物制药行业在过去的三十年中投入大量时间、金钱和人力，开发出了高效的单抗生产工艺——CHO细胞和补料分批工艺被广泛的应用于单克隆抗体的生产。相对于其他细胞培养工艺比如：分批培养、灌流培养、连续培养，补料分批培养具有更加突出的优点更高的生产效率、便于操作更快的开发速度。在20世纪90年补料分批工艺产率只有0.1-1g / L，但是到21世纪初，产物浓度已经被提高到1-10g / L。

目前关于补料-分批工艺与分批工艺的对比的文献还没有被报道，可能是因为补料-分批工艺的优势还没有被业界公认。尽管有文献报道，利用补料分批工艺可以使产物效价提高7.6倍相对于传统的分批培养工艺。随着单抗行业的发展，越来越多的企业开始储备相关产品的研发，加快补料分批工艺开发，缩短进入临床的周期已经成为生物制药行业研发的焦点。因此建立细胞培养的分批补料工艺开发平台（细胞培养技术平台，以下称平台）是缩短研发周期的捷径。平台一般通常由公司特定的表达细胞系、表达载体、基础培养基和补料培养基构成。迄今为止关于平台的建设的研究或者报道并没有查询到，本文以本单位平台为基础，简单介绍了平台的建设、应用及其在单抗表达优化中的作用。西尔曼科技亲情翻译摘录，如有不足请索要原文。

二、材料与方法

1. 细胞系：A、B、C来源于CHOK1SV，A16来自于细胞系A的亚克隆

2. 表达载体：细胞系ABC为GS基因表达系统，A表达的为人源化IgG，BC表达的为人源IgG

3. 基础培养基：CD CHO

4. 补料培养基：modifying the CD CHO

（二）方法

1.分批培养：250ml摇瓶，140 rpm, at 37 C, 8% CO2, and 90% humidity

2.补料分批培养：3L或者5L反应器，127 rpm in the 3-L bioreactor and 110 rpm in the 15-L bioreactor，37℃，

补料方法：added continuously into the bioreactors to maintain the glucose concentration at 2 g/L

3.代谢流分析方法：由Metabolon公司利用气相色谱法和液相色谱-质谱法进行

4.抗体质量分析方法：聚集体分析：HPLC system；糖基化分析：reverse-phase HPLC

三、结果分析

1. 培养基研究

1.1 平台基础培养基的选择  

以细胞系A为标准，因为在所有细胞系中细胞系A的细胞数量5.9 *10⁶ cells/mL和单抗浓度510 mg/L都是最高的。

1.2 补料培养基的确定

第一批次的补料分批培养按照相关文献方法进行，补料速率根据葡萄糖的消耗速率，通过连续流加使培养基葡萄糖浓度维持在2g/L。补料分批培养结束以后对剩余培养基的氨基酸、矿物质进行全面分析来确定相关物质是限制性营养物质还是对生长无关的物质。限制性营养物质的定义是在补料-分批培养期间该物质的浓度下降到接近于0 mmol/L，生长不相关的物质指的是培养结束时该物质的浓度大于初始培养基的浓度。当营养限制性物质和生长不相关的物质被确定以后，我们就可以对补料培养基进行进一步的优化。由于我们对基础培养基和补料培养基缺乏完全定量的分析的方法，我们只能以某种物质剩余的量为基础进行比例计算，举个例子我们通过分析发现，最后分批补料培养结束后剩余的葡萄糖浓度为2g/L，某种氨基酸的浓度为0.1g/L，那么我们就可以根据这个比例去额外增加这种氨基酸的比例，其他的相关物质也可以用类似的方法去计算。营养物质的量确定以后我们还要考虑物质的理化性质，要保证补料培养基不会出现沉淀、变色等不良现象，验证的最好方法就是在常温下放置一个月，观察培养基外观的变化。

1.3 验证补料培养基

为了评估平台基础培养基和补料培养基的性能，按照上述方法，使用10-L生物反应器对A、A16、B、C细胞系进行平行实验。

按照2.5 * 10⁵cells/mL进行接种，细胞密度最高达到1.7 * 10⁷cells/ mL，357小时以后细胞存活率维持在80%以上，单抗产量达到5 g/L，较之前提高了10倍。

通过代谢组学分析发现胆碱是补料分批培养中潜在的限制性营养物之一。 在培养213小时时，废培养基中的胆碱浓度几乎为零（图2f），而含有胆碱的补料培养基在培养93小时后连续供给，胆碱消耗的时间点、细胞密度达到最大值的时间点和细胞存活率降低的时间点基本一致。

1.4 富集胆碱的影响

为了验证胆碱是否是补料分批工艺中的限制性营养物质，设计了2倍胆碱含量和4倍胆碱含量的补料培养基，以细胞系A为研究对象在2L反应器中进行试验，接种量1.4*10⁶ cells/mL，结果细胞密度在166h达到峰值1.7*10⁷ cells/mL。详细结果如下图：

胆碱对单抗聚体的影响

胆碱对单抗糖基化的影响

四、总结

作为生物制药产业发展最快的领域之一，越来越多的治疗性抗体目前也处在了研发阶段。然而每种单抗生产的细胞系的培养基优化至少需要数个月的时间，如何更加有效地缩短开发周期，将成为生物药物研发所要面临的最大挑战。如何建立细胞培养技术平台成为了能否成功研发出高质量生物药物的关键所在。

建立适合本单位的细胞培养技术平台，一般采用以下三种策略。第一种策略是开发全合成培养基，因为它能够根据细胞系的特点合理均衡的配置各种成分明确的化学物质，避免补料分批培养过程中限制性营养物质和过量营养物质。在第二种策略中，我们选择了单一的CHO细胞系，其在合成培养基中的分批培养中显示出最高的细胞密度，基于共同的细胞系，共同的表达载体有相似的营养需求的假设，进行基础培养基和补料培养基的开发。第三，我们选择葡萄糖作为细胞代谢的指标，以确定所有其他营养物质的补料速率，因为葡萄糖可以容易且准确地离线和在线测量。本研究证实了这三种策略的有效性，因为在没有对其他细胞系进行培养基优化的前提下，三种不同细胞系获得的mAb浓度分别达到8.4,3.3和6.2 g / L三种细胞系的峰值细胞密度范围在1.3×10⁷ -1.8×10⁷ cell/ mL之间。

在补料培养基优化期间，我们发现补料分批培养期间胆碱限制导致细胞活力降低，mAb滴度降低，mAb聚集体含量更高，甘露糖含量更高。胆碱是生物合成磷脂酰胆碱所必需的，磷脂酰胆碱是细胞膜的主要成分。胆碱限制可能导致高尔基体膜缺陷，从而导致更多的mAb聚集体和更高的甘露糖-5含量。胆碱也是细胞培养基的重要组分，在多个细胞培养基配方中都能看到胆碱，比如MEM、DMEM和Ham's F12等但是MEM、DMEM和F-12中氯化胆碱与葡萄糖（氯化胆碱/葡萄糖）的比例分别为0.001,0.00089和0.0079（它们之间的差异达到九倍）。对于我们的补料培养基，单次胆碱培养条件下氯化胆碱与葡萄糖的比例为0.00285（图5），并且这个比率是在细胞系A的补料分批培养期间的胆碱限制。所得到的两倍和四倍胆碱培养物单抗效价增加16％，并且与单倍胆碱培养物相比，也导致类似的mAb质量改善。因此，我们得出结论，胆碱与葡萄糖之比为0.0057和0.0114在mAb生产滴度和细胞系A的补料分批培养的mAb质量方面是最佳的。

迄今为止，还没有研究针对CHO细胞补料分批培养的培养基中的胆碱优化，本文首次报道到了培养基中最佳胆碱比例及其对CHO细胞补料分批培养中mAb浓度和mAb质量的影响。另外我们还发现mAb聚集体含量高和糖基化过程中甘露糖-5含量高是mAb A的固有特征;对于类似培养基的细胞系B、C并没有观察到mAb聚集体含量和甘露糖-5含量高的情况（数据未显示）。因此，本文选择了选择产生细胞系A来揭示了胆碱浓度对聚集体含量和甘露糖-5含量的影响。

文章来源：Cytotechnology    发表日期：2018年1月