重症联合免疫缺陷病（Severe Combined Immunodeficiency，SCID）是一种婴儿致命性的紊乱，这种病常常在出生后好几周才有明显的临床症状。SCID可通过造血干细胞移植（hematopoietic cell transplantation，HCT）得到有效的治疗，并有强有力的证据表明在无症状期进行早期干预可获得较好的结果和提高生存。以前，仅仅是有SCID家族史的婴儿才在出生时就进行检测。以家庭为基础的调查显示出生时进行检测的婴儿存活为85%而出生时未进行检测的新生儿存活率为58%。2001年，从临床上积累的经验和证据使SCID被确定为NBS公共卫生的目标。2005年，Chan和Puck发表了一种使用实时定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）检测NBS中TREC含量的方法来发现SCID。2008年，Wisconsin开始在实验室使用实时qPCR检测TREC进行第一次基于人群的前瞻性的SCID NBS初步研究。2009年，Massachusetts采用内部控制多通路实时qPCR TREC试验进行SCID NBS预试验项目。从此美国和全球其他NBS项目已经将SCID引入到它们的常规筛查中，并且更多的NBS项目正在努力获得实施。
重症联合免疫缺陷病（Severe Combined Immunodeficiency，SCID）指的是一群主要以T细胞发育和功能严重损伤为特征的疾病。SCID新生儿筛查（newborn screening，NBS）可用于鉴别患SCID和其他紊乱造成的严重的T淋巴细胞减少症的新生儿。任何相关的基因缺陷可能导致SCID和其他T细胞减少症导致的紊乱。
SCID的典型临床表型以早期的极度易感性为特征的免疫缺陷。根据不同基因突变将导致不同表型和淋巴细胞缺陷。虽然许多单基因缺陷与SCID有关，诊断主要还是取决于严重的T淋巴细胞减少和T细胞功能紊乱。治疗的目标是防止感染和最终实现免疫重建和恢复正常的细胞和体液免疫。
原发性免疫缺陷病（Primary immunodeficiency disorders，PIDD）形成接近200种具有各种各样临床表型和疾病严重程度的先天性疾病群。许多PIDD已知与单基因缺陷有关，但还有些PIDD仍然不知道或可能由单基因或多基因导致。重要的是，PIDD从临床上区别与其他继发性免疫缺陷。通常根据免疫学机制和由根本缺陷导致的临床表现将PIDD进行分类。虽然一半以上的PIDD都属于抗体不足，但TREC试验主要适用情况是SCID。虽然所有SCID的发病率估计在1:50000至1:100000之间，但根据经验，来自NBS项目的数据是低估的。随着科技的进步和对原发性免疫缺陷病的了解，许多其他PIDD可能会在未来被发现。
新生儿SCID通常出生时表现为健康。整个身体出现红斑鳞状皮疹可能是最早的SCID的表现之一。因感染或吸收不良，许多婴儿发展为顽固/慢性腹泻,导致体重增加障碍（发育停滞）。出现症状的中位年龄是8周；3个月之前，大多数婴儿将经历严重的感染。患SCID的婴儿容易感染细菌（如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌），病毒（如巨细胞病毒、单纯疱疹）和真菌（如念珠菌属）。他们尤其容易机会性感染 (如卡式肺，隐孢子虫)。感染是复发性的，并可危及生命。此外，婴儿接种减毒活疫苗（如轮状病毒、卡介苗、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘）后可能患严重的传染性疾病。由于母亲T细胞移植或输入没有经过去白细胞或辐照的血制品后，严重T细胞减少患儿可能产生移植物抗宿主病。
重症联合免疫缺陷病包含一组以T细胞缺少为特征，因不同分子缺陷而导致的联合免疫缺陷疾病。大部分免疫学家认为至少有14种基因缺陷与SCID典型的表型相关。大部分SCID基因缺陷是单基因常染色体隐性遗传，除外一种X性联缺陷（编码IL2共同γ链的IL2RG突变）。除了幼稚T细胞的缺少，基于B细胞和自然杀伤细胞（natural killer，NK）(TBNK分类)，大部分SCID基因型具有清楚表述的免疫表型。
这部分包括讨论TREC试验应用的理论和对此方法目前应用于SCID NBS的描述。其中还包括DBS参考物质（NBS-RMs），检验前、检验中和检验后质量保证（quality assurance，QA）要素，以及简要强调SCID NBS项目应该监测的实验室和人群数据。
两种类型定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）（实时qPCR和单点qPCR）通常用于定量靶序列。它们均依赖于PCR特异性扩增DNA靶序列和主要用荧光标记进行校准，但它们不是一个用于常规筛查的高通量的方法。
最常见的qPCR类型是实时PCR，实时PCR通过荧光信号记录PCR反应的每个循环。指数期内荧光信号到达阈值的扩增周期（量化周期[Cq]）分数作为仪器读数。目前，实时qPCR被所有SCID NBS项目所采用，它是唯一一种附有SCID新生儿检测临床确认文件的分析形式。大部分实时qPCR仪器都适用于这种检测，包括384孔板，它允许在一次循环中分析更多的样品。
第二种类型的qPCR基于预定时间点或扩增周期的单一荧光谱检测。扩增是在最优的扩增周期中进行，扩增之后对反应信号减小检测。扩增数目由这一次荧光读书决定。这种类型的检测有时被称为“单点”qPCR或“终点”qPCR。目前，终点qPCR法检测DBS中TREC正在发展中，但这种方法还没有在基于NBS人群的初步研究中应用和确认。
这两种类型的qPCR都可用于检测DNA序列的相对数目或绝对拷贝数。绝对拷贝数的检测需要与校准物比较，后者具有相应拷贝数浓度的独立的分配值。
第三种qPCR类型是数字PCR，这种PCR最近已由商业化仪器开发。原则上，数字PCR提供绝对目标序列拷贝数而不要参考独立的标准。数字PCR用于检测DBS样品中TREC正在开发。
用于SCID NBS的TREC试验必须能够区别DNA模板缺乏或非常低拷贝数的样品与只有较低拷贝数DNA模板的正常样品。新生儿DBS样品收集的变异性增加了鉴别异常TREC水平的难度。由于TREC试验是基于PCR扩增DNA，所以一些可能影响反应的因素包括：不适当的样品；不能从DBS中将足够的DNA洗涤下来；或存在肝素之类的PCR抑制剂。为了保证较低的TREC结果不是人为因素导致（造成假阳性筛查结果），SCID NBS应该包含对参考基因中保守序列的扩增试验。目前SCID NBS试验使用核糖核苷酸酶P（RNaseP）或β-肌动蛋白基因序列。
使用校准曲线来决定TREC拷贝数，其中校准曲线是通过稀释含TREC序列的质粒或TREC序列转染的细胞系绘制的。
由于DBS标本的独特属性，应该使用DBS参考物质时常监测、评估和审核NBS定量试验。DBS参考物质也是用于开发和确认实验室NBS检测方法的重要工具。在方法开发和常规质量控制方面，DBS参考物质都提供了校准参数之外的方法性能的次级评价。
来自SCID或T细胞缺陷征确证新生儿的剩余DBS是非常有价值的实验室参考物质，这些参考物质应该储存于尽可能好的储存条件下，并被节约用于实验室内或之间的特殊评估。这部分将讨论替代DBS参考物质的使用。这些参考物质可能由NBS实验室制备或来源于外部机构。目前，TREC试验的DBS参考物质的主要外部来源是美国CDC。
DBS参考物质被用于分析质量控制（quality control，QC），以评价DBS TREC试验在正确鉴别后面三种类型样品的性能：TREC处于新生儿期望范围内的样品；TREC低于新生儿期望范围的样品；基因组DNA不能扩增证明其TREC结果不确定的样品。
每种类型的样品需要不同制备的替代材料。为了提供长期QC和实验室间评价足够的材料，需要能够提供大量同质DBS的生产方法。CDC已经开发出了这种方法，并已在一些NBS实验室实施。
代表新生儿期望范围的DBS参考物质最好用脐带血制备，因为外周血中TREC随着年龄增长而减少，而老年人中TREC则是微乎其微。由不同TREC水平的脐带血样品制备的不同批号DBS参考物质将评估期望范围内的分析性能。具有较低水平TREC的DBS参考物质对于评估分析性能尤其有用。
阳性对照应该代表SCID类似样品，即不含或含很少TREC，但具有正常的内标基因水平。来源于老年人血（通常大于50岁）的DBS样品常常是合适的SCID阳性对照，但必须证实每个捐赠单元，当用DBS检测时，不包含或很少TREC。可通过密度梯度离心去除T细胞和其他单核细胞从而进一步去除捐赠血中TREC，但随着捐赠者年龄增长，此种分离变得不那么有效。去除成人血中单核细胞可使基因组DNA水平降低至低于正常新生儿血液中DNA期望范围。一种更有选择性去除新鲜血液中T细胞的技术，如免疫磁珠，对于超过8小时的血样品，其T细胞去除效果将不那么好。
用于反应由于DNA量不足或检测方法中的问题导致无法扩增的DBS参考物质应该包含在分析中QC中。这些既含有TREC，其内标基因含量又低于新生儿期望范围的参考物质，可以来源于去白细胞的成人血。
用于分析中QC的DBS参考物质应该在多个实验室进行评估，以建立分类指定值的一致性。CDC制备的DBS参考物质被用于多个实验室的模拟性能力评估调查（Model Proficiency Evaluation Survey，MPES）。一旦要求，CDC也可能会评估NBS项目生产的DBS材料，这些材料也可能会被其他NBS实验室评估。
DBS参考物质的适当储存将确保储存过的样品的可靠性。DBS应该储存在含干燥剂和湿度指示剂的较少气体的透水带中。当多个DBS储存在相同的容器中时，应该用实验室称重纸或半透明纸隔开，以防止可能的交叉污染。虽然正式的稳定性研究还有待此指南的发表，但CDC MPES的结果表明DBS中的TREC至少能够储存在4℃~-20℃含干燥剂的环境下24个月。
NBS实验室的NBS分析前QC包括血斑点收集、运输、处理和标本评估。综合性的处理请参见CLSI文件LA04。
分析中QC也叫实验室内QC，是实验室执行的一套用于持续评估实验室工作和检测，以决定结果报告是否足够可信。分析中QC的主要目标是为了确保检测或观察结果的临床准确性和天与天之间的一致性。
当针对TREC检测的分析中QC涉及用于其他新生儿DBS半定量试验相同的方法时，其对DNA污染的关注程度更高。通过PCR实现每个样品中TREC DNA的指数式扩增，其扩增产物是原TREC的百万倍。因为SCID NBS取决于TREC量缺乏或很低的鉴别，所以很少量的扩增产物污染都会导致错误的结果。因此，NBS实验室应该制定方案用于防止DNA污染以及方法内的对照用于鉴别可能发生污染。应该特别注意由以前试验扩增造成的可能污染或实验室用于校准的质粒的TREC污染。
无论是TREC还是内参基因扩增子都不应该在NTC中检测。每个实验室应该设定TREC或参考拷贝数的范围，超过此范围分析将会无效。任何偏移都应该调查，发生偏移的样品应该重新检测，除非有证据证明此偏移不会影响患者标本的结果，并且所有其他对照都在可接受的范围内。
除了污染问题，针对TREC试验是分析中QC的其他方面对于NBS实验室一般是熟悉的。实验室每天的检测中应该包括正常对照（筛选阴性）和如同SCID对照（筛选阳性）。理想的情况下，正常对照应该包含足月儿TREC期望范围内含不同水平TREC的DBS，一般制备于脐带血。此种对照应该绝对落在筛选阴性范围内。传统的用于跟踪TREC定量结果不精密度的方法也适用于这些材料。类似地，如同SCID对照应该明确地落在筛选阳性范围内，即TREC拷贝数低于阈值，内参基因值高于扩增失败的阈值。TREC拷贝数的分析中QC不适用于如同SCID对照给出TREC值缺乏或很低。然而，如同SCID对照中内参基因的实时qPCR结果，不管是通过多通道试验与TREC同时检测还是单独检测作为对应都应该进行监控。最后，实验室可能还需要包括落在不确定范围的白细胞低的样品，因为此样品的TREC值和内参基因值都低于足月新生儿期望范围。
作为每天分析中QC程序的补充，NBS实验室可能进行周期性的盲对照。盲对照由先前已经表征的新生儿DBS标本组成，并将其以检测员工未知的方式加入到标本流中。这种盲对照的检测频率通常是每个月或每两周进行一次。
作为分析前QC和分析中QC的一部分，实验室应该复查所有第一次检测TREC值低于实验室阈值的样品。通常，DBS标本新的槽孔是重复的一式两份，并在第二天进行分开检测。这不仅保证了TREC结果也适当地鉴别了标本，它为实验室提供了额外DBS孔用于单独检测内参基因。
筛选结果的报告、后续阳性结果的判定、确诊、治疗和管理所有NBS系统的关键分析后组成元素。这些组分有相关的QC活动来确保其持续的质量管理。
NBS分析后阶段的整体QC已经在性能评估和评价项目（Performance Evaluation and Assessment Scheme）中进行了全面的讨论。QC程序中应该特别注意确保具有假定SCID阳性结果的新生儿体内的活疫苗被抑制。
这部分讨论如何将SCID NBS试验整合到已经具有DNA分子诊断方法基本知识的运行的NBS实验室。给出了SCID NBS实验室运行、实验室设备和实验室操作的总则。
PCR扩增单个分子的能力意味着微量的DNA污染可作为模板导致假阳性的扩增反应（扩增错误的模板）。DNA污染最常见的来源是以前准备的DNA、质粒DNA或以前PCR扩增产物。为了防止污染，实验室在做PCR时应该遵循一般的操作或程序。
详细的工作流程图是仪器选择和实验室员工分配的重要管理工具。在决定哪里最好使用自动化仪器以及是否有必要满足生产量方面尤其有用。一个工作流程图应该包括的内容是：实验室操作/处理小时；给定的时间或周转时间内处理的样品/板的数目；负载水平，即每周检测量是否可以结清；接收的标本的浮动情况，即检测数目每天是否变动，例如，在特定的某天（通常是周一和/或周二）接收的标本量特别大；员工数目局限性（例如，可获得固定工作时间的员工数目；加班是否允许/可接受）。
SCID试验的处理过程围绕试剂吸取、样品洗脱液和洗脱样品/DBS。任何情况下，除了将4个96孔板浓缩为一个384孔板，自动化设备在出故障时都可以手工操作代替。当每天有8块或更多板进行扩增时，就需考虑使用384孔板。自动化需要将4块96孔板浓缩为384孔板。
通常，较小的检测量偏向于手工方法，较高的工作量可能需要使用自动化设备。最优的工作流程可能同时使用手工和自动化方法，例如，手工准备DNA，而PCR的建立可以是手工或自动化。筛选SCID的NBS实验室目前可能提供实验室TREC试验准备至实施的指南。
这部分概括了现有NBS实验室实施SCID NBS系统的主要步骤，以便在试验阶段确认后能将稳定的试验方法直接整合到常规NBS中。
通常，常规SCID NBS实施之前将进行运行确认的试验阶段。试验阶段的准备包括制备符合美国临床实验室改进修正法案（例如标准化操作规程）临时的操作手册，这个临时手册可能随着方案经验的积累而得到修改，并在试验阶段的总结环节定稿，随后在修改得到实行前必须进行管理审核。通常，试验阶段设计的目的应该是提供一个基于人群常规筛查的无缝过渡。
检测匿名的剩余新生儿DBS对于在试验阶段建立筛查阈值和估计可能的筛查阳性是有用的，但是应该尽快进行总结以减小遇到真正的病例。试验阶段可能包括新生儿鉴别检测，根据研究设计和影响NBS项目的法律和政策，常常需要知情同意。同时，这种试验阶段也应该尽快完成以减小真正案例发生在患者集之外的风险。
NBS项目过往的经验是有用的，NBS项目已经使用预实验模型来实施其他遗传疾病或紊乱的筛查试验。已经执行过一项SCID NBS系统的NBS项目的经验是特别重要的资源。计划实施SCID预筛选的NBS项目将面临一些基本的问题。第一主要的问题是获得预实验的经费，这常常是关键的限制因素。NBS项目不得不确定预筛查的范围，特别是是否检测所有新生儿或限制预试验至一个亚人群。还必须确定将要用于检测的设备。另外，应该确定试验阶段的持续时间。在实施预试验前，NBS项目应该确保所有用于SCID新生儿筛查的工具和基础设备可以获得。
SCID筛查预实验的主要目标是确定将SCID试验整合到现存NBS试验项目中的最好方式。将SCID整合到常规NBS筛查中的费用和人力将在预试验阶段进行评价。其他将被处理的问题包括：检测方法的特异性和敏感性；对患者和医学界群体有关SCID的教育；与卫生保健提供者的沟通；及时报告结果质量；追踪阳性筛查；验证试验的有效性；转介SCID诊断和治疗方面的专家；治疗设备的可获得性。
任何预试验应该遵守相关法律，包括那些保护受试者免受研究风险的法律。预研究项目中已经使用过不同的模型。通常，一项豁免的研究可以用于开发和一些分析确认。随后，项目将进展到一致的试验的阶段或者从那开始真正的试验。一项预试验可以正式研究或当作一项“豁免的”的研究执行。一项正式的研究通常要求得到研究和涉及新生儿DBS样品收集的医疗设备执行代理的机构审查委员会（institutional review boards，IRB）的审核和批准。如果试验阶段检测可辨认的标本，那么通常要求完整的知情同意。预试验以豁免研究的方式执行的化，要求向IRB申请豁免，使用的申请理由为预试验被认为是项目开发和项目评价。豁免通常要求标本是匿名的，移除了任何跟踪的可能。
CLSI文件LA04详细描述了标本收集、运输和处理过程。质量差的标本导致筛查的延误，如果其他标本没有及时收集将增加失去跟踪的风险。诊断的延误可能造成受影响新生儿发病率和死亡率的增高。
最好是通过足跟采集标本（参见CLSI文件LA04）。在不能使用足跟采集标本时，可收集来自脐、静脉或动脉的标本。因为肝素可能抑制PCR，用于采集血样品管中的肝素可导致认为的TREC值变小或假阳性结果。合格采集后，应该让DBS标本干燥至少3个小时。为了防止交叉污染，标本之间不能接触。储存时可以使用分隔材料或交替叠放来保护DBS标本。
标本应该在采集24小时内邮寄或者递送到筛查实验室，如果可能的话，应进行跟踪。
DBS标本禁止在密闭和防漏密封容器（如，塑料或箔衬袋）中包装。因为密封容器的内部环境缺乏气体交换，所以将导致热度增加和水分积累。高温、直射阳光、湿度和水分不利于DBS标本的稳定性和分析物回收。含干燥剂的包装将有助于防止水分积累，但由于运输条件不可控制，干燥剂的效果也是有限的。实验室最新的经验表明，含干燥剂的DBS，其TREC能够稳定在4℃~-20℃至少24个月。
DNA分析血斑点处理的一般的用法说明可参见CLSI文件LA04。血斑打孔机和切削工具的维护和清洁对于移除打孔机、穿孔头或切削工具中的线和碎片是重要的。血斑打孔机和切削工具的清洗可用漂白剂或稀盐酸处理切削表面。将样品加到多孔板中后，推荐使用与标本相同的切削工具在空白滤纸上至少打一个孔。
用于PCR的DBS孔的大小可能不同，从小于1mm到大于3mm。一个来源于红细胞压积为55%DBS的3.2mm（1/8英寸）的孔包含平均3.4μl的全血和平均237ng提取的DNA。
TREC试验是开发要求对多个组件做出选择：试验平台、引物和探针、每部参考基因和结果分析（阈值的确定）。
方法1——样品洗涤/DNA洗脱/PCR：这种方法使用3.2mm DBS孔，开始于室温下的洗涤步骤。纯化缓冲液与标本一起孵育以消除样品中PCR抑制剂（如血红蛋白）。随后通过洗脱缓冲液孵育和加热斑点，DNA从有核细胞中释放出来。然后一部分洗脱的DNA用于实时qPCR检测TREC。纯化和洗脱缓冲都是商品化的，但也可实验室制备。洗涤步骤可执行一次或多次以减少其影响。
方法2——样品洗涤/直接PCR：这种方法在执行洗涤步骤后，对孔直接进行PCR。标准的PCR混合物加入管中，并进行加热以释放洗涤过的孔中DNA至PCR混合物中。操作中使用更小的孔，如1.5-2.0mm，因为整个孔中有足够的DNA用于PCR扩增。
方法3——直接PCR：这种方法采用来源于干血斑点NBS标本的1.5-2.0mm的孔。与方法2类似，PCR循环中并入了加热步骤以释放滤纸上有核细胞中DNA至PCR混合物中。这种方法准备的样品可能包含PCR抑制剂，因此PCR混合物中可能包含一种阻止此种抑制的试剂或可能稀释模板以获得高效的扩增。
传统的实时qPCR试验是用提取的DNA，这种方法被许多NBS实验室采用。替代的适用于DBS的方法是一种叫作“卡片上的”或“原位的”扩增，其DNA保留在孔中，根据产品定量程序被直接用于实时qPCR或终点PCR。这种方法不需要分离提取DNA，且因为需要更小的孔（1.5-2.0mm）所以其需要的DBS材料也较少。这种直接的方法的局限性在于其限制使用96孔板，因为384孔板中管子太小以至于不能接受打孔器。另一个局限性在于只有采用装有光电倍增管或光电二极管信号扫描系统的实时qPCR仪才能实现最优的性能，因为电荷耦合成像摄像机获得的图像可能被血斑点孔所扭曲。
除了目标DNA，实时qPCR试验的其他主要组分包括正向引物和反向引物、扩增产物的特异性探针、PCR标准混合液。几对引物和特异性结合TREC序列的探针已经在NBS实验室中获得较好的结果。引物对扩增的PCR产物应该与TREC信号结合部位重叠以确保其特异性。没有迹象表明任何适当的探针和引物组合优于其他组合。
TREC试验中使用的DNA的量取决于采用的方案和总的反应体积。对于使用抽提的DNA的检测方案，将只会消耗一小部分的抽提物。每个反应使用的提取物的量，不同方案间不同，通常相当于0.1-1.0 μL的全血体积。实际反应中DNA的量取决于DNA提取的效率和被检测的DBS。1.5-2.0mm孔中的全血大概含50-90ng DNA。对于不使用提取的DNA的原位试验（直接在孔中检测），其参加反应的实际DNA量取决于加热步骤释放细胞内镶嵌于纤维中的DNA到PCR反应液中的效率。
各种各样用于实时qPCR的由DNA聚合酶、无机盐、镁和脱氧核苷三磷酸盐组成的商品化的即用型混合物已经成功用于抽提qPCR或洗脱卡片上的/原位qPCR TREC试验中。那些发展为“无洗脱”的方法需要专门的突变DNA聚合酶和特殊的佐料去抵消抑制剂的影响。即用型引入防止PCR产物污染的尿嘧啶DNA糖苷酶（uracil-DNA-glycosylase，UNG）系统的PCR混合物是值得考虑的选择。UNG通过从结合的脱氧尿嘧啶单磷酸盐中移除尿嘧啶来破坏污染的分子。在实时qPCR中DNA聚合酶（15min 95℃）反应的那一步，UNG是未激活的，将不会影响目标DNA序列的扩增。在后续循环，只有目标核苷酸将会被扩增，而不会扩增来源于以前反应的污染的核酸。
选择的引物和探针、商品化的PCR混合物、DNA（提取的或原位的）和水（如果需要）按照适当的比例混合，得到PCR反应中每种成分的适当浓度。根据检测方案的不同，总的反应体积可从10μL（典型的384孔板）、15μL（原位）到20μL（典型的96孔板）变化。
基本的qPCR包括两个阶段。第一阶段包括加热至95℃并维持10-20min，在这一阶段DNA变性并且DNA聚合酶被激活。第二阶段包括40-45个交替加热至95℃（变性）和冷却至60℃（退火和延伸）的循环。使用UNG的系统在第一阶段开始前将有2分钟50℃的额外孵育，让酶消化掉污染的DNA。对于每个循环中变性和退火/延伸的时间，针对TREC最佳的时间设置取决于使用的试剂和仪器，并应该通过经验进行验证。
实时qPCR进行定量检测要求进行两个单独的数据分析阶段。首先，热循环中获得的荧光值必须转换为单一的响应值，称为Cq。其次，具有TREC量指定值的参考物质的响应参数值被用于绘制校准曲线，校准曲线被用于计算样品中TREC的含量。
实时qPCR的原始数据由每次热循环后的荧光强度读书组成。通常，与实时qPCR仪器相连的软件将原始仪器读数转换为循环数Cq。Cq指的是生成的荧光强度读数值达到一定的较高值以至于不能探测到PCR扩增。
根据原始数据确定Cq值有两种主要方法。第一种方法是建立荧光阈值，然后计算反应达到此阈值时的循环周期数。这种方法可以直观地从样品PCR曲线重叠部分形成的荧光阈值水平线与每个样品扩增曲线的交叉点得到Cq。荧光阈值可由仪器中软件计算或由分析者通过直观观察人工设定。人工通过直接观察扩增曲线设定的阈值可能优于仪器算法自动给出的阈值。因为在直观观察中，以循环数为X轴，log荧光值为Y轴绘制的扩增曲线可以很好的观察。一旦建立，用户定义的阈值可以在每一批中保持不变，并可对不同批间数据分析进行一致性评价。此外，在实现试验一致性的的实验室中，固定的阈值允许进行天与天之间简单的检测结果的比较。
另外一种用于确定每个扩增曲线Cq值的方法是通过确定光滑曲线的二次导数到达最大时的循环周期数。扩增曲线的二次导数的最大值将在扩增曲线指数阶段起始的附近。这与样品中荧光信号有急剧增强的转折点相一致。这种导数法求Cq值计算复杂，必须使用软件，后者大部分作为实时qPCR仪器的一部分。
两种方法确定Cq值均有其优点和局限性。荧光阈值法取决于基线荧光确定的准确性。实时qPCR软件中有不同的方法用于基线矫正，或用直接观察进行基线矫正。二次导数最大值法不需要设定固定的荧光阈值，并允许单独分析每个反应曲线。然而，它可能没有荧光阈值法精确。
DBS中TREC浓度必须从校准曲线总计算得来，其中校准曲线的X轴是校准物中的TREC值，Y轴是Cq。TREC校准曲线通常是由不同TREC DNA稀释浓度的校准物绘制而成，其中校准物的浓度是独立确定的。通常校准物与样品和质控品包含在每批试验中。
一旦输入校准品的值，实时qPCR仪中的软件将会绘制校准曲线并计算样品和QC材料中的TREC值。为了不同批结果的一致性，应该监控校准曲线参数和QC材料的结果。根据校准曲线性能和其他QC参数来判断试验是否可接受。根据作为质量保证的参数中的校准曲线的斜率、Y轴截距和线性来评价校准曲线。在实时qPCR中，斜率被用于指示PCR的效率。因为Cq值（Y轴）随着TREC浓度（X轴）的增加而减小，所以斜率将是负值。通常实时qPCR试验是效率在85%到115%之间。Y轴截距代表一个单位浓度目标DNA向对应的Cq。实验室应该根据历史数据建立斜率和Y轴截距的最大值和最小值。拟合优度可通过决定系数推算，决定系数是相关系数的平方。决定系数接近≥ 0.985意味着不同浓度间扩增效率一致。斜率、Y轴截距和决定系数可通过删除有限数量的Cq值超过每个实验室标准范围的异常值来进行优化。然而，如果为了使校准参数落在建立的QC范围内而过多的删除异常值，那么此校准曲线是无效的。
即使校准曲线是令人满意的，根据QC样品和QC参数，如每天样品中位数和每批次统计允许发生的不确定和阳性结果，试验也可能不可接受。
通常实验室必须实施控制程序来监控方法或所使用的系统的稳定性。质控品和校准物间接评估患者检测结果的准确度和精密度。实验室必须使用与患者标本相同方式检测QC样品，并且只有当质控结果满足实验室标准时才可接受。
每个实验室必须在操作手册中编入用于监控和评价检测过程质量以确保患者检测结果准确和可信的QC内容。在检测结果报告前，QC结果必须在可接受范围内（在操作手册中进行了定义）。对于落在建立的可容许范围之外的QC数据采取的适当纠正措施必须包含在操作手册中。特别注意，无论什么时候更换或改进试剂或仪器进行的首次确认后，需要求QC结果。
结果编辑指的是收集将组成筛选报告内容的患者信息和数据的过程。由于大量的筛选标本，最好进行自动化结果编辑以防止印刷上和/或换位错误。从TREC试验中获得的分析结果应该表示为每微升全血中TREC拷贝数。当检测仪器软件报告每个反应中拷贝数，那么将需要使用软件将值转换为每微升全血中拷贝数。分析结果连同用于鉴别的检测标本的标签/条形码应该与管理人口统计学资料和婴儿标本收集信息的数据库向相关联。因为SCID筛查是个主要的筛查试验，SCID结果应该被并入其他主要NBS试验结果报告套餐中。
参考文献
1. CLSI. Blood Collection on Filter Paper for Newborn Screening Programs; Approved Standard—Fifth Edition. CLSI document LA04-A5. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2007
2. CLSI. Newborn Blood Spot Screening for Severe Combined Immunodeficiency by Measurement of T-cell Receptor Excision Circles; Approved Guideline. CLSI document NBS06-A. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2013.
北 国家卫生计生委临床检验中心——李婷婷 王治国
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