今天，科技君总结了大家拿到转录组测序或者RNA-Seq结果后的各种难题，快来看看，你中了几条？
难难难
1. 得到的差异表达基因太多（或者太少）？
2. 功能分析结果到底靠不靠谱？
3. 技术验证只做到qPCR这步行吗？
4. 做功能验证，样本怎么设计好？
……
是的，如今有很多研究课题是关于基因表达的，并已经发现了一些现象，但分子机制还不清楚。而做转录组测序或者RNA-Seq特别适合用于此类分子机制研究，可以一次性得到样本中几乎所有表达的mRNA信息。其优点自然是全面撒网，不漏掉任何可能的基因，不过也会带来以上的这些问题，其中最让人头疼的就是得到的差异表达基因总是太多了！
那么在茫茫基因中，你该如何找到心仪的目标基因呢？下面我们来看看一般的转录组及RNA-Seq测序后锁定目标基因的方法。
1. 初步筛选：差异表达基因分析
通常利用转录组测序或RNA-Seq，通过实验组和对照组基因表达量比较，筛选差异表达的基因，你可能会获得几百个基因。
有时大家说差异表达基因太多，而有时又说太少，实际上确实很难有一种方法适用于所有人的需求，因为样品来源非常广泛，无论是物种、组织部位、时期、还是处理条件等，所以我们提供DEGseq、DEseq2、EBseq、NOIseq和PossionDis共5种差异基因检测方法供选择，总有一种最适合你。可以调整筛选的条件，比如差异倍数。
2. 缩小范围：功能分析
接下来缩小范围，进行功能注释，注释到你关心的功能上的基因是重点研究对象，到这一步可能只有十几个到几十个。
大家都想要获得全面准确的功能注释结果，我们提供GO、Pathway，以及转录因子预测、蛋白互作关系、真菌致病基因预测、植物抗病基因预测等，是不是很全面？
不仅全面还得可靠，做功能分析依赖于数据库，所以必须用最权威可靠的数据库。别的不说，做Pathway必用KEGG数据库，华大基因是中国唯一获得了KEGG官方授权的商业提供商！我们分析流程中KEGG数据库注释持续更新，始终保持最新版本。
3. 确定存在：技术验证
随机选取十几个基因或者前面功能分析找到的十几个基因做验证，qPCR最常用，还有Northern杂交，FISH等方法，确定这些基因是存在并且差异表达了，就可以说明测序结果真实可靠。
别走开~，下面就是如何继续锁定目标，为文章加分的大招了！
4. 锁定目标：功能验证
方法无非是两种，让某个基因减少表达，或者提高表达。如果在表型上有变化，就可以确定这个基因真实地发挥功能。
（1）过表达
过表达某个基因，方法如构建过表达转基因载体，侵染细胞或愈伤组织，观察过表达后是不是现象更明显了。
（2）敲除、敲减
敲除或者敲减某个基因的表达，方法如siRNA干扰，观察敲除敲减后是不是现象反转或不明显了。
当然，如果两个都做，互相印证，那么证据就更加充足了。
另一方面，从样本角度，越多样本验证，可信度越高。
数量上：从小样本到大样本
临床研究上：除了数量上，还需要从细胞实验、动物实验到临床实验的验证。
经过各角度全方位功能验证，目标基因想找不到都难！
说了这么多理论，让我们一起来看看实际案例吧。来看看下面这篇BGISEQ-500 RNA-Seq文章是如何将这些理论落实到实践中的。
文章题目： 拟南芥AtACS8基因在铜离子激活下，在乙烯早期生物合成中起关键作用
发表期刊：Journal of Cell Science
发表时间：2017年8月
发表单位： 山东农业大学
背景：表型实验确定铜离子促进拟南芥乙烯合成及其信号通路，从而能引起防御反应，但是分子机制不清楚。
选择样本做RNA-Seq：铜离子处理0、2、24h，2个生物学重复，共6个样品BGISEQ-500 RNA-Seq。
差异表达基因分析：发现2000~3000多个差异表达基因
功能分析：铜处理后快速地受诱导的基因中，发现十几个参与乙烯生物合成的基因，到此并不知道谁是关键基因。
技术验证：qRT-PCR验证这些乙烯合成基因，所有的基因都验证上了，确定测序结果可靠。
图1 功能分析和技术验证（铜离子处理后乙烯生物合成通路基因的表达与验证）
功能验证——敲除：为了找到功能分析中十几个参与乙烯合成的基因，究竟哪个是关键基因。构建敲除突变植株，检测铜处理后乙烯水平和合成通路的标记基因表达水平等，确定AtACS8基因是关键基因。为了找到该关键基因中的关键元件、构建突变体、定点敲除等方法， AtACS8启动子区的铜响应顺式元件（CuRE）是关键元件。
图2 功能验证（AtACS8基因启动子敲除实验）
结论：铜离子特异性激活拟南芥AtACS8基因表达，来促进乙烯早期生物合成，进而引起依赖于CuRE调控元件的拟南芥防御反应。
这篇文章很好地展示了，如何先利用测序全面撒网，得到很多差异表达基因，再利用功能分析缩小到十几个基因，然后技术验证确定测序可靠、功能验证锁定目标基因。
简单概括锁定目标基因的方法：
针对测序前的样本选择，之前科技君也发过一篇微信，请点此回看。
撰稿：赵 青
编辑：市场部
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