师姐,上次你给我讲的RNA提取小诀窍太有用了,之后提取RNA一直很顺利,走咱俩看电影去呗~
不用谢,应该的嘛~,看电影没问题。师姐实验很顺利,有的是时间~
师姐你怎么这么神?说到实验我又遇到了新问题
,RNA检测报告我看不明白,求教师姐~
没问题,不过电影是不是还得再看一次啊
~
好啊,没问题~
继上次小编帮助学弟解答RNA提取相关问题后,(感兴趣的小伙伴可戳RNA提取又不合格?那你一定需要了解这些~),又要为小师弟解答RNA检测相关的问题~你若是也存在同样的疑惑,请认真听小编的讲解~
检测方法
1)1%的琼脂糖电泳检测RNA样品是否有降解以及杂质。
2)NanoPhotometer® 分光光度计检测样品纯度。
3)Qubit® 3.0 Flurometer检测RNA样品浓度。
4)安捷伦2100 RNA Nano 6000 Assay Kit检测RNA样品的完整性。
涉及指标
RNA样本总量及完整性是评判样品质量的关键点,其中RNA完整性评估依靠RIN值、28S/18S(或者23S/16S)以及Agilent 2100 检测峰图基线是否平整来综合评判。对于降解样本难以获取完整的转录本信息,影响数据质量及完整性。当RNA总量较低时,会导致建库成功率低,或数据dup率高等问题。下面小编就来详细介绍每个指标代表的意义。
RNA电泳胶图
RNA 电泳胶图主要需查看以下几方面:
1)看目的条带是否明亮清晰
2)看泳道内是否有降解弥散区
3)看胶孔处有无蛋白污染
4)看有无DNA污染
5)看有无外源物种核酸污染
目的条带明亮清晰,泳道无弥散区,无蛋白和DNA污染的样品质量较好。
动物样品胶图上可见目的条带为28S、18S、5S,植物样品为25S、18S、5S,昆虫或者软体动物18S、5S,原核样品23S、16S、5S。下面是两组不同质量的RNA电泳图示例。
RNA质量较好的示例
外源污染和降解示例
RIN值
RNA Integrity Number(RIN)数值大小即反应样品完整性情况,数值越接近10表明样品完整性越高,反之RIN值越小完整性越差。特殊样品需结合2100峰图一起评估。Agilent 2100 Bioanalyzer检测不仅可以得到样品RIN,还可以得到样品的浓度和28S/18S(原核生物为23S/16S)。
Agilent 2100 Bioanalyzer
28S/18S
28S和18S比值(28S/18S)是评估样品完整性的另一项指标,真核生物的比值大于等于1.5 表示RNA完整性较好,如比值逆转,则表明RNA降解。
原核生物23S/16S数值大于等于1.2 表明RNA完整性较好。
节肢动物的RNA在2100检测前热变性的过程会使28S拆成两个片段,所以节肢动物无28S/18S判定指标。
2100峰图
如下是两个RNA样品2100检测结果示例。
真核生物样品完整性较好2100检测峰图
真核生物样品完整性较差2100检测峰图
可知2100检测会提供2100峰图、样品浓度、28S/18S、RIN值、峰面积、模拟胶图等信息。峰图中需重点查看基线是否平整,有无降解杂峰,28S与18S峰形及比值。
OD260/OD280 OD260/OD230
OD260/OD230与OD260/OD280均用于判断RNA纯度,分别表示RNA样品中有无碳水化合物和蛋白质污染。
A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,如酚,糖类等;A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长,如 RNA,DNA,引物等;A280nm 是蛋白质最高吸收峰的吸收波长。
纯RNA:1.7 <OD260/280<2.0(<1.7时表明有蛋白质或酚污染;>2.0时表明可能有异硫氰酸残存)。纯 RNA的OD260/230比值为2.5,若比值小于2.0标明样品被碳水化合物(糖类),盐类或有机溶剂污染。
NanoDrop 2000微量分光光度计
了解以上信息,看懂RNA检测报告就是小case了~
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