我读书少，你表骗我——最清楚的QPCR原理讲解

本文介绍QPCR的检测以及相对定量原理。

我读书少，你表骗我——最清晰的QPCR讲解（一）

在前面我们介绍过QPCR结果如何分析作图（可以查看历史消息或者登录科研狗网站http://www.keyangou.com），接下来我们将分几次逐步介绍QPCR的原理和注意事项。

（一） QPCR定量原理

1 理解PCR

PCR简单来说就是一变二，二变四的等比增长的过程，如下图：

图1： 理想情况下PCR产物与循环数关系

但是，这里面存在一个问题，并不是每次循环都会翻倍，比如说每次扩增只有90%的底物参与了扩增（扩增效率为0.9），这是理论情况下的PCR反应：

图2 理论情况下PCR产物量与循环数关系。

但是由于上面都是在酶，buffer等都是足量，且不存在其他抑制反应的情况下的曲线，所以实际PCR曲线如下：

图3 实际情况下PCR产物数与循环数的关系

刚开始的时候酶，缓冲液，能量，dNTP等都是充足的，PCR按照理论情况下的扩增（A: 指数期），限速因子为底物的量；

随着时间的增加，产物越来越多，每次循环所需要的酶也就越来越多，当达到B（线性期）阶段的时候，所有的酶都参与了扩增，因此每个循环之后产物增加量是恒定的，和酶的数量相关，此时限制产物增加的因素是酶；

当达到C（衰退期）阶段时候，酶逐渐失活，dNTP消耗殆尽，产物增加量逐渐减少；

直至到D阶段，没有任何产物生成，数目保持恒定。

2. QPCR简单原理

我们可以将每条PCR产物带上一个荧光标记（具体怎么回事下节讲解），这样的话有多少个PCR产物就有多少单位的荧光，因此：

荧光 正比于 DNA产物数目 某种关系于 DNA初始量

因此我们通过机器收集荧光的量就能知道DNA初始量了，那么机器如何收集荧光呢？

有两种方式可以收集荧光

第一种是我们固定一个循环数C1（比如25个循环），然后循环结束之后我们分别收集每管的荧光，这种情况下，R2处于对数期，R1处于衰退期

图4 固定循环数测定荧光强度值

第二种是我们固定一个荧光强度值，看达到这个荧光强度值需要多少个循环

图5 固定荧光强度测试循环数

只要我们把R0设置合适，R0这条水平线就能切割到所有的处于对数期的曲线，我们qPCR采用的就是这种模式，下面我们来看下为什么这种模式能够反映出DNA初始量（以下推导中lg代表以2为底的对数）。

一大波推导公式来袭~可直接看最后公式

所以当我们知道每个样品达到一定荧光强度阈值时所需要的循环数n（qPCR里面称作Ct）时，就能知道初始浓度的对数值。假设我们做了细胞内p53mRNA和GAPDH的qPCR，那么我们得到了Ct(p53)和Ct(GAPDH)

lgN(p53)= K1 X Ct(p53) +K2,

lgN(GAPDH)=K1 X Ct(GAPDH) + K2

我们想看p53相对于内参的表达量时：

如果你有一个实验组和一个对照组，那么实验组比对照组的比值就是2^-△△Ct，意思就是说实验组的mRNA水平是对照组的多少倍（Fold change）。

那么为什么不能用图4（固定循环数，测最终荧光强度值）的方式来衡量初始浓度呢？那是因为固定循环数的情况下，有很多样品不处于对数期，荧光的量与初始浓度没有特定的关系，无法计算初始浓度。

好了，不知道你是否已经明白其中的原理，我们下一节将介绍qPCR仪器运行的原理，让你真正理解qPCR~

“这哪是最清晰的QPCR讲解啊？”

“客官请息怒，科研狗会努力做好，希望提出宝贵意见！汪汪汪”

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