Puromycin嘌呤霉素盐酸盐

作用机制：

嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。嘌呤霉素作为氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。但是嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。 

抗性基因： 

对嘌呤霉素的抗性取决于编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC)的 Pac基因，遗传工程研究使用的Pac基因分离自嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger。 

最普遍应用：

1）嘌呤霉素如今普遍应用于筛选和维持培养含Pac基因的哺乳动物稳定转染细胞。嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。

2）在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。 

化学特性：

化学名称：3 (a -Amino-p-methoxyhydro cinnamamido)- 3–deoxy- N,N–dimethyladenosine·2HCl

CAS No.：58-58.2，  分子式：C₂₂ H₂₉ N₇ O₅ .2HCl， 分子量：544.43 g/mol

纯度：＞98%（HPLC）,易溶于水5-50mg/mL，-20度保存。

应用浓度：

哺乳动物细胞的推荐使用浓度为1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定。

LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。

使用步骤：（哺乳动物细胞筛选）

►嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）

为了筛选到稳定表达待研究shRNA的细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。所以初次做实验的客户一定要建立适合自己体系的杀死曲线（kill curve） 。

（1）24孔板内以5~8 x 10⁴ cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；

（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；

（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；

（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；

（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。

（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。

►嘌呤霉素筛选稳定转染细胞

（1）day 0：24孔板内以5~8 x 10⁴ cells/孔的密度铺板，孵育过夜；

（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；

（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。）

（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜；

（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。

（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；

（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。

注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。

储存方法和稳定性：

嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；

嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20°C，保质期为2年。

应用文献：
1.为了说明Parp1基因和ADP核糖多聚体位于Dnmt1启动子上和说明Parp1能够保护自己的非甲基化状态，向培养基中加入2μg/mL的嘌呤霉素筛选稳转株，质粒为 pBabe-puro（Addgene公司）；

2.为了研究生化信号通路能够在嘈杂的分子环境下传递信息，采用6ug/mL的puromycin进行细胞筛选。
3.为了研究IRP2（离子调控蛋白2）特定的73个氨基酸插入与该蛋白致瘤特性的关系，采用2µg/ml 的嘌呤霉素筛选稳定转染的人H1299肺癌细胞系。

4.为了证实在p53缺失的细胞中，被O-GlcNAc修饰的IKKβ的催化活性有所增强，使用了1μg/ml的嘌呤霉素来筛选感染腺病毒（载体为pBabe HA-IKKβ wild type）的细胞。
5.为研究跨膜交互作用在KAI1/CD82介导的对癌症侵入和转移的抑制作用中所发挥的角色，使用2μg/ml的嘌呤霉素用于筛选稳定的Du145-sh2和-sh3转导子，并用1μg/ml的嘌呤霉素维持培养 （pSIREN-RetroQ 逆转录病毒转染）。
6.为了研究Per1在调节肝脏对四氯二苯并-p-二恶英反应中的作用，使用了4μg/ml的嘌呤霉素筛选稳定感染腺病毒的 Hepa1c1c7细胞，腺病毒载体为 pSilencer 5.1-U6 Retro Vector (Applied Biosystems/Ambion)。

7.为了证实蛋白激酶PKR可以诱导细胞凋亡和抑制缺乏C蛋白的麻疹病毒亚型的生长，使用 1μg/ml 嘌呤霉素来筛选稳定转染的HeLa细胞，载体为 pSUPER.retro.puro Vector。