正如笔者去年关于生物技术药中残留DNA检测技术进展文章中所预测，美国药典今年9月在药典论坛42(5)发布了编号为<509>的通则征求意见稿，反馈的截止日期为2016年11月30日。该草案详细阐述了qPCR法是残留核酸检测的唯一推荐方法。这一变化可能会对企业的单抗、疫苗等重组药物的研发、注册、生产提出了更高的要求。熟悉美国药典的同行们知道，编号大于1000的通则属于比较宽泛的一般介绍，而编号1000以内的通则属于用户需要特别注意与遵守的技术要求，包含有检测技术、系统适应性标准和标准物质。现行USP中对于残留DNA检测的通则编号为<1130>，其中简单介绍了杂交法、阈值法及qPCR法检测原理及应用。但随着药品质量要求的提高，及对核酸残留危害的认识加深，USP意识到必须尽快统一检测方法。USP于2014年成立专门委员会，验证修订<1130>中的各种检测方法，最终推出了更准确、可靠、科学的qPCR法作为残留DNA检测的唯一推荐方法。由此可见，2015版中国药典附录收载的探针杂交法和荧光染料法渐渐不能满足产品生产与质控的要求，已逐步被发达国家药典所淘汰。据悉，我国药典会已经组织中检院专家开始验证qPCR方法用于生物技术药中宿主残留DNA的检测，最终可能会公布包括CHO、E.coli、毕赤酵母、Vero、NS0等多个物种的探针及引物序列，还将考察碘化钠法及磁珠法用于样品前处理的可行性。如果验证工作进展顺利，预计qPCR法将会出现在明年的药典增补版中。对于国内生物技术药的研发与生产企业，以及生产纯化填料的上下游企业，建议尽早建立以qPCR方法为基础的宿主残余DNA检测体系，必将有利于新药注册申报、工艺优化、质量提高，并实现与欧美发达国家生物药品质控技术的接轨。
详细解读USP通则<509>最新征求意见稿
前言：USP这次发布的内容包括了碘化钠的提取方法和qPCR的检测方法，以及CHO、E.coli两种DNA标准物质。目前常用的微量DNA提取方法有：碘化钠法、磁珠法、柱层析法，基于提取技术和操作技巧的差异，可能会影响加样回收率。另外，虽然USP公布了引物及探针的序列，但并未详细公布Mix的配方，用户需要购买商业试剂，并需验证其在本qPCR体系中的适用性。最后，由于前处理试剂及检测试剂分别由多个厂家提供的商品组合而成，用户可根据自身待测样品的特点调整试剂配方。USP或中国药典公布的探针和引物序列仅供参考，非强制要求，但为建立稳定、可靠的检测方法，笔者建议用户选用已验证过前处理试剂与检测试剂匹配性的成套试剂盒，或对自建方法进行系统的适用性验证。
以下为USP发布的<509>拟修订内容译文：
<509>残留DNA检测。在生物技术产品在细胞体系生产过程中，必须尽可能减少产品中宿主细胞DNA的残留。因此，在工艺过程检测或放行检测时要求生产方提供宿主DNA减少或清除的证据。这次新发布的章节提供了一种经过验证的检测方法，适合检测E.coli和CHO细胞表达基因重组治疗产品中宿主细胞残留DNA的含量。这个章节也包含了一个可选择使用的提取方法，适用于qPCR检测前的微量DNA提取。【提交建议截止日期：2016年11月30日】
<509>残留DNA检测
简介：下面介绍的方法适用于检测E.coli和CHO细胞表达的重组治疗生物产品中宿主细胞残留DNA含量。也提供了一种可供选择的DNA提取方法，用于qPCR检测宿主细胞残留DNA的样品前处理。关于这种方法的原理和实践介绍，请参考“核酸检测技术—微量DNA检测方法”<1130>通则。
实验方案
l 样本制备
很多DNA提取方法可能适用于生物技术药物类样品。下面详细介绍的提取方法，验证了起始DNA浓度从0.01到50pg/μL范围的适用性【备注：其他提取技术经方法学验证后也可用于qPCR检测技术】。
重悬溶液：10mM（pH8.0）Tris-HCl、1.0mM EDTA 缓冲溶液。
DNA标准品储备液：用重悬溶液稀释USP CHO基因组DNA参考品或E.coli基因组DNA参考品，浓度为1μg/mL的溶液。
样品溶液：待测样品可能需要稀释或再浓缩，以满足以下目的：1）克服基质对DNA回收率的干扰；2）调整到合适的起始体积；3）把待测样品的浓度调整到qPCR方法的定量检测范围以内。样品可以根据需要用水或者重悬溶液稀释。对于药品原料的样品，如有相应限度要求，样品溶液应当包含足够的起始量，以便确认残留DNA的含量。
阳性对照溶液：通过在样品溶液中加入DNA标准品储备溶液，制备适用于该检测方法的合适浓度的溶液。
阴性对照溶液：在提取流程中，用水或者空白重悬溶液替代样品溶液，进行提取操作。对阴性对照溶液进行qPCR分析，确认分析操作中不存在背景DNA干扰和交叉污染。
70%乙醇：加水至乙醇中制备终浓度为70%（体积比）的溶液。
蛋白酶K溶液：加水溶解、EDTA、SDS试剂，制备分别含100mM（pH8.0）、5mM、100mg/mL的混合溶液。加入蛋白酶K[1]至终浓度为10mg/mL的溶液。
碘化钠溶液：6M碘化钠、15mM EDTA、0.25%亚硫酸钠、0.5% 、25mM Tris-HCl（pH8.0）、35μg/mL丙烯酰胺。在制备100mL溶液时，磁力搅拌器混合并按顺序加入：50mL无核酶的水，0.25g亚硫酸钠，3.0mL的0.5M EDTA溶液，2.5mL的1M Tris-HCl（pH8.0）；接着慢慢加入89.93g碘化钠。最后加入无核酶的水定容至100mL。采用0.2μm尼龙膜过滤器过滤【备注：这个储备液能够在4℃暗处保存一年】。使用当天，加入丙烯酰胺及sodium N-lauroyl sarcosinate至终浓度分别为35ug/mL及0.5%（w/v）【备注：sodium N-lauroyl sarcosinate加入碘化钠溶液后可能产生浑浊，可于提取操作前置于50~55℃水浴加热2-3分钟，帮助消除沉淀】。
提取操作：取2mL离心管，加入450μL的样品液、阳性对照液（各包含三个重复）及至少一份的阴性对照液，然后加入50μL蛋白酶K溶液。混匀并于60±2培养1-24小时。加500μL碘化钠溶液到每只离心管中。混匀并于40℃培养15分钟。加入900μL的100%乙醇，混匀并放置室温15分钟。于10,000×g离心15分钟收集DNA沉淀【备注：于较低的温度环境下离心有助于提高DNA回收率】。小心移除上清液，加1mL的70%乙醇（含3μg/mL丙烯酰胺）洗涤沉淀，离心，弃去上清液。空气干燥约5-10分钟，直到观察没有明显的液体残留。用合适体积的水或重悬溶液溶解DNA沉淀。记录实际的样品回收和体积改变情况，以便将来计算最终结果。
l qPCR分析
2×Master Mix：包含有氯化镁、dATP，dCTP，dGTP，dUTP，dTTP，以及高纯度的Taq酶[2]。使用前混匀。
DNA引物及探针储备液：根据待测DNA的物种，合成以下基因序列，分别制备无DNA酶的10uM水溶液（表1）。
表 1
E. coli：
Forward primer 5′-CCTTACGACCAGGGCTACACA-3′
Reverse primer 5′-CTCGCGAGGTCGCTTCTC-3′
Probe5′-CGTGCTACAATGGCGCATACA-3′
CHO：
Forward primer 5′-CCTGAGTTCAATTCCCAGCAA-3′
Reverse primer 5′-ACATTCTGCTTCCATGTATATCTGCA-3′
Probe5′-TGGCTCACAACCATCCGTTATGAGACCT-3′
DNA探针溶液：用DNAse-free的水稀释DNA探针储备液到2.5μM。
标准溶液：稀释DNA标准品储备液，制备5个或更多浓度范围在0.001~100pg/μL的标准溶液。
分析测试
待测样品：样品液、阳性对照、阴性对照、标准溶液；
【备注：如果样品经过提取，应加入提取的样品液及提取的对照溶液】
转移25μL的2×Master Mix到96孔qPCR板每个孔中，分别加入对应检测物种的DNA上下游引物、探针溶液各5μL。加入10μL样品液（提取）、标准溶液、阴性对照液（提取）、阳性对照液（提取）到不同孔中【备注：qPCR的反应体积应该根据所用仪器进行调整，已期达到最好效果】。混匀，密封平板，1000×g离心1分钟。将平板置于qPCR仪中，50孵育2分钟，95℃10分钟，接着运行40个循环，每循环维持95℃15秒及60℃1分钟【一些仪器和试剂要求预孵育过程，注意厂家建议】。使用合适的荧光检测设备观察标记探针的信号。根据仪器生产厂家的建议设置阈值。记录每个样品的Ct值。
数据计算
标注标准溶液log值所对应的Ct值，计算斜率和截距。使用以下方程式计算每孔中DNA的总量。
Ct＝样品液的阈值循环数
b＝标准曲线的截距
m＝标准曲线斜率
计算每个样品溶液的DNA含量，计算最终浓度需考虑每次浓缩或稀释操作。
系统适用性
样品：阴性对照液及标准溶液
适用性要求
阴性对照液：阴性对照品的Ct值不少于标准曲线最低浓度的Ct值。
灵敏度：标准溶液最低浓度（标准曲线最低一个点）的Ct值不大于39。
线性：标准曲线回归系数不低于0.98。斜率在-3.1~-3.8之间。
操作合格标准
任何可检出样品浓度必须落在标准曲线范围内。
准确性：三个重复阳性对照样品的平均回收率在50~150%之间。【备注：如果有提取操作，应注意修正稀释倍数】
相对标准差：检测样品三复孔之间不大于30%；阳性对照品三复孔之间不大于30%。
来源：中科院上海生科院湖州营养中心
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