作者：麦子（转载请注：解螺旋·医生科研助手）
现在科研大多是80末、90后当道了，这一代网络原住民可能早在入坑之前，就学会了用PS把自己的照片弄得美美哒，磨皮瘦腰不在话下。后来听说PS居然也是科研常用软件之一，是不是顿时觉得自己老司机附体！
且慢，发文章用的图片，如显微镜图像、凝胶图像、病例报告中的各种临床照片，跟日常美照可不是一回事呀~尽管我们多多少少都会一点PS或其他的图片处理软件，但科研可是有规矩的。
事实上，图片处理问题在本世纪初便引起了多家杂志的注意，但一直绵延到2009年，才形成了一套成文的指南，最初是洛克菲勒大学出版社撰写的，后来美国科学诚信办公室（ORI）和科学编辑委员会（CSE）都推荐。现在许多杂志的图片处理政策也都以此为基础。
不幸的是，这么多年过去了，总有人有意无意地犯错，因图片不当而撤稿的事情屡见不鲜；在已接收的稿件中，也有近1/4的稿子因图片问题被要求返修。为了避免浪费时间，或无意中将自己陷入“造假”的质疑声中，咱们还是了解一下这套规矩吧。
科研数码图像恰当使用及处理伦理指南
1)科技数码图像是一种数据，有可能因不恰当的处理而失真。
数据不仅是我们熟知的什么蛋白浓度、血压等直观的量化记录，从显微镜、照相机获取的图中所有像素都属于实验数据（Image data）。它的亮度、对比度、饱和度等，都是对实验的真实记录。有时候我们想通过调整图像对比度让背景更“干净”，却无意中把背景上的数据抹去了。
调整背景不是不可以，但也有“度”。在PS中，可以通过强度直方图来理解。
Sci Eng Ethics. 2010 Dec; 16(4): 639–667.
这是一个软体动物四细胞胚胎的共聚焦显微镜图像，展示其细胞骨架。上边的就是强度直方图，表示图片中各像素的灰度值的分布。最左是原始图，中间的是正确地调整，右边的是错误的调整。有什么区别呢？
我们本来也不需要太了解PS的原理细节，但不少人都知道可以用Ctrl+L调出“色阶”对话框，通过调整直方图来改变图像对比度，从而使背景更“干净”。问题就在这里！
这个直方图的形状应该保持不变！像中间的正确图那样调整色阶，它的直方图相比于原图，形状没变，只是中间多了一些空隙，那是因为经过软件的运算把图中最暗的点变成全黑，最亮的点变成全白，相当于把直方图拉宽了。
但如果随意截取直方图的其中一段，可以得到如右图这样更加“个性鲜明”的图，但有一部分像素记录的信息被你截掉了。直方图上左右两边箭头指示的长柱子，就是不当操作的罪证。
这是最常见的错误操作。所以正确的做法是先从“窗口→直方图”调出直方图，从右上角菜单中选择扩展视图、显示统计数据，才有了图下方的那些数据。
我用另一张图的色阶演示一下。鼠标悬浮在直方图左右两边较平扁的区域来回滑动，可以看到色阶和数量的值在变化。如果从左右最边上的色阶（0和255）各自向中间移动，有一段色阶的数量都是0（说明位于该色阶上的像素是0个），那么从第一个数量不是0的色阶开始，才是允许你截取的部分。
找到那个色阶之后，调出色阶对话框，在直方图下的框中分别输入刚才你找到的左右两个色阶值就好了。当然如果一开始数量不是0，也就没什么可调的了。如下图，左边刚才找到最后一个数量为0的色阶是13，那么调整时应该填14；右边没有数量为0的色阶，不能动。
但有时候，错误操作从拍照的那一刻就开始了。相机的设置中，曝光过度或曝光不足，还有光的强度不合适，都会造成信息读取不充分，与上述过程相似。但这源头上的损失是很难挽回的。所以拍照的时候有一点点背景信号不必介意，太干净了可能意味着相机设置有问题。
2)处理数码图像，只能对原始图像文件的副本进行操作（必须保持原始文件安全且不作任何改变！）
这容易理解吧，保留原图，可以在处理完之后作对比，确认有没有扭曲实验真相，还能在错误操作之后安全地重来，最重要的是，杂志编辑可能会索要。
但你对“原始图像文件”这个概念是怎么理解的呢？若从显微镜相机导出Jpeg，就已经不是原始图了，一般是用TIFF无损格式。但这还没完。从显微镜导到自己电脑上，要整个文件夹一起拷过去，这样会附带一个Metadata文件夹。
里面有好多咱看不懂的东西，但不要删掉，它记录了拍照时的相机参数，重复实验时也需要用到，所以它也属于原始数据的一部分。有的杂志甚至会要求提交这个作为Supplementary Information。
3)只是对全图作简单调整往往是允许的。
简单调整包括对图片的亮度、对比度、色阶、曲线等等的轻微调整。它们的本质也是对直方图做各种运算变换，比如左移右移、拉伸压缩等等。但曲线背后的运算法则并不是线性的，一般不提倡使用。如果非用不可，一定要在图注中说明。
多大程度的调整才算合理，却有点难说。原则就是不隐藏、消除、歪曲原图中的信息。参考1）中的例子。操作时要记下流程和参数，当被问起时要能答复就行。
也不提倡使用软件的自动色阶、自动对比度、自动亮度等功能。因为这种一键搞定的操作，很难说清它对图片做了什么。
4)裁剪图片往往是允许的。
裁剪也是常用的操作，问题在于动机。莫不是要把什么“见不得人”的东西给裁掉？那些自己不喜欢、不理解的东西，或不支持假设的东西？这属于可疑动机啊。
可接受的裁剪理由只包括，让一个关注重点的物体位于图片中心，或裁掉周围的空白区域及无关紧要的东西，但不能改变原图所表达的意义。
还有一点，裁完之后剩余的像素仍需满足杂志的印刷要求。如果不满足了再通过调整像素、分辨率来改变大小，会造成图片失真。
5)用于互相对比的图像，需在同一条件下获取，并且任何后期处理也需相同。
不管是定性的还是定量的对比，都应该在同样的条件下获取，这跟实验的控制变量思路是一致的。条件包括拍照时的光学环境和相机的设置，犹其是后者，通常要在文章的Methods中记录，或至少在图注中说明。
6)仅对图像某一区域处理而保留其他区域不变，属可疑操作。
用“选区”工具框住一部分，比如凝胶图像上的某个特殊条带，然后再做上述的亮度、对比度等调整，就属此类，绝大多数情况下是不允许的。
7)对生物学图像来说，使用软件滤镜提高图像质量的做法通常不推荐。
不止PS，许多图像处理软件都配备一大堆滤镜，网络上那些非主流、忧伤、怀旧、明媚等气氛浓烈的图片，就是用各种滤镜实现的，大多数小伙伴可能都发过加滤镜的朋友圈照片吧~
这是一类对像素进行运算变换之后形成的视觉效果，运用不当也有可能歪曲图片信息，比如加个lomo镜，周边就暗了下去，中心突出，色彩也绚丽，那么周边的信息就给弱化甚至消除了。
允许使用滤镜的情况极少极少，但还是会有杂志考顾周到，比如Nature。若必须用，也要在Methods或图注中说明软件名称及版本，滤镜名称和详细参数。
8)将同一图像或其他图像中的物体拷贝至当前图像，属非常可疑的操作。
先理解一点，这里的“物体”可以包括细胞、条带、污点等我们一眼就能看出的物体，也包括无意义的一小块背景。于是，把一个细胞复制到别处，或复制一小块背景来盖住污点，都属于这类操作。
PS里有很多神奇的工具可以做到，比如仿制图章、修补工具、污点修复画笔工具等等，用它们来袪痘袪斑不留疤，效果完胜市面上任何一款面膜面霜。这妥妥的造假啊！
你说你冤枉，只是你的组织切片上真的有个污点要处理，那干脆另选一个视野拍照吧。实在不行就重新制作切片好了。
另有一种拼合图片的情况是允许的，比如把几张凝胶图像的某几个条带拼在一起比较，这样就得用明确的分割线表示它们来自不同的原图，像这样用黑色边框分隔开：
J Vis Exp. 2014; (84): 51149.
9)用于测量强度的图片需进行统一处理，且测量数据需用已知的标准进行校正。
与5）有一点类似，但强度测量有其特殊性。常见的例子如荧光显微镜图片测量荧光强度，或免疫组化DAB染色测染色强度。
后者还好，因为它曝光之后也不会有什么变化。但荧光切片的光学环境要求就苛刻得多，因为它会在曝光之后淬灭，随时间推移也会发生变化，所以时间也是获取图片时需要控制的条件之一。
最好是在原始图片上测量。如果对某张图片做了处理，也要对其他图片进行同样的处理。
10)避免使用有损压缩。
这在前文也提到过。无损压缩是指压缩图片大小而信息不失真，最常用的是LZW算法下的TIFF格式。
生活中常用的JPEG格式是有损压缩，图像可以变得很小，不占空间，但数据丢失得更多。而且它每打开、保存一次，就又运行一遍那个有损算法，也就是又丢了一部分数据。
科研图片中，每一个像素都有它的价值。有些杂志还允许提交较大较清晰的JPEG文件进行印刷出版，但无论如何，自己要保留一个TIFF版本，以防被问起。
11)放大倍率及分辨率非常重要。
图片分辨率由设备所采用的技术，以及操作者的设置共同影响。前者我们基本没法控制，除非换设备，后者则是我们可以尽量做好的。当然是在获取图像时，把分辨率往高处设置了（即“采样过密”）。
图片的放大倍率是根据图片分辨率及像素计算的，加上比例尺时，通常用实验室配备的专业软件就挺准确，但最好不要把它嵌入图片使其无法更改，因为杂志编辑在付印时也有可能改变图片大小，这就可能导致比例尺不准确。所以比例尺应该做为单独组件，使其有重新计算、修改的余地。
12)通过调节像素来改变图片大小需谨慎。
为了适应杂志要求，很多时候都要改变图片大小。大家都从日常经验中知道放大图片会模糊，但其实缩小也是要谨慎的，因为日常咱也没观察过几微米的东西，没感觉而已。
通过改变像素的方式改变图像大小，是有几种算法的。比较保险的算法是2^n：
PS的中文版翻译还有点怪怪的，总之它的意思是2^3。使用其他软件时，也最好选用类似的算法。
但无论怎么算，总是有扭曲的，此类操作最好只使用一次。并且，比例尺要在此操作之前加上。
最后有两点要谨记：1. 应在文中（Methods或图注中）说明图片做了何种处理；未加工也要说明；2. 当索要原始数据而作者不能提供时，接收稿件的决定可被撤销。
参考资料：
1.Avoiding Twisted Pixels: Ethical Guidelines for the Appropriate Use and Manipulation of Scientific Digital Images
2.https://www.councilscienceeditors.org/resource-library/editorial-policies/white-paper-on-publication-ethics/3-4-digital-images-and-misconduct/
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