本文作者：张慧慧（长沙 湘雅附二）
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1 克隆载体：
表达载体一般需要的是编码序列（起始密码子ATG到终止密码子TAA/TGA/TGA的序列），也就是NCBI的 coding sequence（CDS）。
一般情况是全长序列，直接取ATG开始的20bp为上游引物，TAA/ TGA/ TAG端的20bp的反向互补序列反向引物。根据载体的酶切位点、读码框的要求在引物的5’端碱基即可。
要注意的是：
①选用的酶切位点在编码序列上是否存在，存在就选择其他酶切位点或者选用同尾酶。
②载体的标签实在插入序列的上游还是下游，在上游编码序列的终止密码就要留，在下游编码序列的终止密码就要去掉。
③读码框是否正确，有些酶切位点会破坏插入序列的读码顺序，这个时候在引物上添加碱基使其正常读码即可。
例如构建EGFP-C1-P53质粒。
① P53序列
绿色表示选取的引物位置（EGFP-C1的GFP标签在插入序列的上游，所以终止密码保留。）
引物序列是：上游引物（与绿色标示的序列一致）5'-ATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3'；下游引物（与绿色标示的序列反向互补）5'-TCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3'
②载体多克隆位点（MCS）分析
我选择酶的原则是价格便宜，常用的酶，例如XhoI/BamHI/HindIII等，这样的酶在很多载体中都会有，有时候可以通用。
分析p53的序列中是否有XhoI/BamHI两个酶切位点，结果是没有，那就可以放心的用这两个酶了。于是引物可以变成
上游引物
5’-CTCGAGATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’（XhoI）
下游引物
5’-GGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’（BamHI）
酶在发挥作用的时候要有个保护碱基，我认为就是给它一个空间让它发挥作用，保护碱基在百度百科可以查到，于是引物就会变成
上游引物
5’-ccgCTCGAGATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’
下游引物
5’-cgGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’
③读码分析
XhoI的序列CTC GAG与载体的读码框不一致，载体的读码是 TCT CGA GCT，当用XhoI/BamHI双酶切载体时，最后的CT需要插入序列的AT来代替，就会使插入的序列移码，这时候，只要在插入序列ATG的前面加CT即可，所以引物序列就变成
上游引物
5’-ccgCTCGAG CTATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’
下游引物
5’-cgGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’
所以当你给公司发引物序列时就是
上游引物
5’-ccgCTCGAG CTATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’
下游引物
5’-cgGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’
因为是全长序列，就表示引物已经定了，没有选择。截短体也是一样的，只要确定了那一段，只要把两端的20bp作为引物序列，然后添加酶切位点序列就可以了。
２ qPCR引物
这里给大家推荐几个网站：
①GenScript Real-time PCR (TaqMan) Primer Design：
https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer#
②Pick primers from a DNA sequence
http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
QPCR设计的原则是：跨内含子，长度在150bp以内。现在的试剂盒已经可以不考虑跨内含子，用①中的网站只要粘贴CDS的一段序列即可，网页中有跨内含子选项，有些时候跨内含子可能无结果，可以不用选这一项。还是以p53序列为例。颜色不同代表不同的外显子。
序列越长，分析的越慢，所以不需要全部粘贴。
结果如下：
只需要L1/R1即可，你可以在word中查找引物序列。
第②个网站，是当时做基因敲除时候用到的，因为涉及到内含子和外显子都要分析，就会有重复序列的位置，这个网站可以用[…]将不需要设计的序列包含在内，所以比较符合要求，（重复序列查找网址http://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker，重复的序列会用NNN标示出来）
P53基因序列的一段，下划线的部分用[….]包括在内
结果如下，除了这些，网页还会给出备选的引物，你可以随意挑选。
有现成的网页可以用，大家大胆的尝试吧，引物设计没有那么神秘。
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