Cas13a：一种与众不同的CRISPR核酸酶

CRISPR是一种出色的基因组编辑工具，深受研究人员的欢迎。其中，大家比较熟悉的是来自化脓链球菌的Cas9（SpCas9）。不过，这并不是唯一的选择。

一种新型核酸酶Cas13a（以前称为C2c2）正逐渐走进人们的视野，它具有独特的性质，进一步扩展了CRISPR工具箱。在此，我们将介绍一下Cas13a的独特性质以及各种应用。

独特之处

Cas13a最初是由Broad研究所的研究人员发现的。2015年，Shmakov及其同事利用Cas1作为“诱饵”，来鉴定细菌基因组中与CRISPR相关联的蛋白。通过此次分析，他们鉴定出53个候选基因，总共分成三大类：C2c1、C2c2和C2c3。C2c1和C2c3与Cpf1有些类似，不过它们需要tracrRNA和crRNA才能切割DNA目标，而Cpf1仅需要crRNA。

再来看C2c2（也就是Cas13a）与Cas9的区别。最大的区别在于Cas13a结合并切割RNA，而Cas9切割DNA。从结构上来看，Cas13a含有两个HEPN结构域，而Cas9用HNH和RuvC结构域来切割DNA目标。HEPN结构域对Cas13a切割RNA目标是必需的。另外，与Cas9类似，Cas13a分子中关键残基的突变可以形成核酸酶活性缺失的Cas13a（dCas13a），它能够结合RNA目标但无法切割。

表1：比较常用的CRISPR酶

名称

结构域

向导RNA

目标

PAM

切割机制

Cas9

HNH、RuvC

tracrRNA、crRNA

DNA

5' NGG

DNA目标中平末端的特定双链断裂

Cpf1

类似RuvC

crRNA

DNA

5' TTN

DNA目标中带有5’垂悬的特定双链断裂

Cas13a

2x HEPN

crRNA

RNA

3' A、U 或C

特定RNA的切割

作用机制

大家都知道，Cas9利用tracrRNA和crRNA来实现与DNA目标的结合和切割。不过，Cas13a只需要24个碱基的crRNA，它通过富含尿嘧啶的茎环结构与Cas13a分子相互作用，并通过Cas13a的一系列构象变化来促进目标的切割。与Cas9一样，Cas13a也能容忍crRNA与目标序列之间的单个错配，不过若存在2个错配，那切割效率就大大降低。它的PFS序列（相当于PAM序列）位于间隔区的3’端，由A、U 或C碱基组成。

Cas13a还有一个特别之处，那就是Cas13a一旦识别并切割由crRNA序列指定的RNA目标，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它将结合并切割其他的RNA，而不管它们是否与crRNA同源，或是否存在PFS。这一点与Cas9截然不同。对于细菌而言，这种性质是有意义的。若细菌被噬菌体感染，它能够激活程序性细胞死亡或休眠状态，以限制感染在整个群体中的传播。

潜在应用

那么，Cas13a可以应用在哪些方面呢？对于初学者来说，Cas13a可用来结合和切割RNA目标，不过这方面的应用可能受限，因为一旦目标被破坏，Cas13a就会失去控制。因此，Cas13a的突变体研究有望成为新的热点，使其特异切割RNA目标，但是随后不会切割非特异的RNA。此外，人们可利用dCas13a来分离群体中的特定RNA序列，或利用荧光标记的dCas13a来研究活细胞中的RNA加工。

最近，张锋实验室还发表了一篇文章，证明了Cas13a可以高特异性地检测RNA单分子。他们开发出的SHERLOCK系统可检测血清、尿液和唾液中低浓度的寨卡病毒，并确定病毒载量，区分不同病毒株。它还可以对人类DNA进行基因分型，并鉴定游离DNA中的肿瘤突变。未来，Cas13a有望继续扩大CRISPR的应用范围。