文末有【彩蛋】
CNS上的一些文章就是测测序、分析分析，用钱砸出来的吗？没钱不行，可是光有钱就行吗？Data driven，PLOS ONE的赶脚；我们崇尚hypothesis driven。我的课题要做成hypothesis driven，不要data driven。真实世界哪分得那么清楚？
今天小丫跟大家分享一篇典型的data driven + hypothesis driven 逐步深入的文章，从机制到临床靶标。每一块内容拆分出来，都是一篇10分的paper。上周发表于Cell，这两篇预热贴《Cell的模式图画反，反，反了》，《RNA-seq居然能挖出这么多机制！给你的文章加5分》说的就是它：
《用别人的数据发自己的Science | 给你的文章加5分》一文用别人的ChIP-seq数据，发现MYC通过结合PD-L1的promoter调控抗肿瘤免疫应答。本文用TCGA的RNA-seq数据，找到了调控PD-L1的enhancer，揭示了PD-L1的远距离调控机制。
思路：
第一步，Data driven
TCGA产生了那么多癌症数据，如何有效利用？我对enhancer感兴趣，能用TCGA的RNA-seq数据找active enhancer吗？先总体看看这些数据适不适合分析enhancer expression（Figure 1），结果还不错。发现：跟对照相比，肿瘤组织有着更广泛的enhancer activation。
enhancer expression是啥，跟RNA-seq有啥关系？你需要补习这篇《RNA-seq居然能挖出这么多机制！给你的文章加5分》
Figure 1. Overview of Enhancer Expression in TCGA RNA-Seq Data
接下来整合其他高通量数据，看看能找到什么线索。TCGA除了RNA-seq以外，还有CNV和mutation数据，整合这些数据，发现：肿瘤组织enhancer的激活与肿瘤非倍性呈正相关，而与点突变无关或轻微负相关（Figure 2）。
Figure 2. Enhancer Expression Is Associated with Different Types of Genomic Aberration
第二步，hypothesis driven
Data driven发现了有趣的规律：肿瘤组织enhancer的激活与肿瘤非倍性呈正相关，机制是什么呢？
提出假设：非整倍性导致染色质开放，从而导致enhancer激活（Figure 3A）。
怎样证实这个假设呢？
既然model里的关键点是染色质状态，那就要用到open和closed chromatin的marker，用ATAC-seq和H3K27ac的ChIP-seq数据标识open chromatin，用H3K9me2和H3K9me3标识closed chromatin。对比发现：open和closed染色质的双链突变率（DSB rate）和点突变率的确呈现相反趋势（Figure 3B）。进一步整合Hi-C数据，证实DNA-DNA interection多的区域 DSB密度高，enhancer密度也高 （Figure 3C），再次证实了假设模型（Figure 3E）。
open chromatin跟转录调控有什么关系？ATAC-seq、H3K27ac、H3K9me2和H3K9me3跟染色质状态有什么关系？你需要补习这篇《等我有钱了，我也这样研究一个基因》里的两个视频。
Figure 3. A ‘‘Chromatin-State’’-Centered Mechanistic Model for the Interplay among Enhancer Activation, SCNAs, and Point Mutations
第三步，深入挖掘机制
上面的“非整倍性-open chromatin-active enhancer”模型最后影响了哪些关键基因，从而在癌症发生发展中起决定性作用呢？要揭示enhancer的功能，就要跟enhancer调控的基因联系起来，从共表达模式入手可以找到enhancer的靶基因。
作者整合了enhancer和mRNA表达数据，找出co-expression的gene和enhancer。这些gene和enhancer可能通过以下三种方式产生co-expression效果（Figure 4A）：
模型一：causal relationship，enhancer的激活导致基因差异表达；
模型二：reactive relationship，基因位于enhancer上游；
模型三：co-responsive relationship，基因和enhancer都受其他分子的影响。
作者重点关注模型一，因为模型一是直接调控机制。从两方面着手：
首先看调控，enhancer突变是否导致基因表达的变化（eQTL）；
然后看结合，enhancer跟gene是否形成loop（Hi-C）（Figure 4B）。
找到了65个这样的interactions，包括49个enhancer和47个gene（Figure 4C），其中有22个已知的原癌基因和8个抑癌基因（Figure 4D），80%的gene-enhancer interaction是正调控。鉴定出的gene-enhancer调控有可能是癌症发展中的关键因素，有潜力成为候选靶标，用于临床治疗。接下来选其中两个enhancer，深入研究。
你也想通过分析转录因子结合和共表达，来挖转录调控关系？强烈推荐这个整合了ChIP-seq和RNA-seq数据的在线挖机制工具《去TCGA看表型，来CistromeCancer挖机制》
Figure 4. Systematic Identification of Causal Enhancer and Cancer-Gene Interactions
第四步，挖掘临床价值
作者选了两个enhancer，深挖其临床价值。
No.1 位于chr22的enhancer，简称它为enhancer 22，SYK可能是它的靶基因。从三个方面着手挖掘enhancer 22的功能：
哪些转录因子结合在enhancer 22上？查看ENCODE的ChIP-seq数据，发现有大量的转录因子在这个enhancer上有结合信号，预示着这里是调控网络中的热点hub（Figure 5A），原理看这篇《他中了国自然，因为最后一周补了这张图》。
enhancer 22的变异会影响基因表达吗？先看转录水平，查eQTL，发现有3个SYK的eQTL。这两个在线工具教你查eQTL《变异会影响转录？SNP影响转录因子结合？RegulomeDB》，《non-coding区的SNP影响了转录？HaploReg视频》（Figure 5BC）。再看蛋白质水平，查TCGA的蛋白表达数据，跟转录水平一致，enhancer activity跟SYK蛋白表达水平正相关（Figure 5DE）。
enhancer 22的变异影响了患者的生存期吗？在很多癌症类型里，enhancer 22变异患者的预后都很差（Figure 5F-K）。这里有方法：《TCGA，她已经用了七年 | 资深用户深度点评》
至此，挖掘出enhancer 22的临床价值：利用enhancer 22调控SYK的这一特点，把enhancer 22作为癌症诊断的分子marker。仅这一部分就是一项完整的研究，妥妥的10分paper。
Figure 5. Enhancer 22 as a Prognostic Marker across Cancer Types
No.2，位于PD-L1下游140kb处，简称enhancer 9。从以下五个方面挖掘其功能：
共表达分析：多种癌症类型中，以及130种肺癌细胞系中，enhancer 9与PD-L1有着强co-expression（Figure 6AB）。
enhancer 9的变异引起PD-L1的表达变化吗？答案是肯定的（Figure 6C）。
enhancer 9和PD-L1之间能形成loop吗？7种人细胞系的Hi-C数据证实，enhancer 9和PD-L1之间形成了DNA-DNA结合（Figure 6D）。
哪些转录因子结合在enhancer 9上？ENCODE的161种转录因子数据当中，只有NF-kB在enhancer 9上有结合信号，同时NF-kB在PD-L1的promoter上也有结合信号（Figure 6E），这再次证实了NF-kB介导了enhancer 9和PD-L1的远距离调控。
敲除实验证实enhancer对靶基因的调控。采用经典的研究单个enhancer对靶基因调控作用的实验，发现敲除了enhancer 9的细胞中，PD-L1的转录水平和蛋白表达确实降低（Figure 6F-H）。
至此，揭示了一个NF-kB介导PD-L1激活的enhancer-promoter相互作用模型。仅这一部分又是一篇10分paper。
Figure 6. Enhancer 9 Regulates PD-L1, a Key Target of Immunotherapy
最后，看看本文一共整合分析了这么多数据，文中都有链接
【彩蛋】
本文通讯作者梁晗，副教授，美国德州大学MD安德森癌症中心生物信息与计算生物系。
2015年，小丫参加了梁晗老师主讲的龙星课程，课程主题就是TCGA，http://210.46.85.200/dragonstar/，对课程ppt感兴趣的小伙伴可以联系嘉因表观小助手，微信号：epigenomics
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