Plus深读 | 组蛋白乙酰转移酶KAT6A/B抑制剂诱导细胞衰老及抑制肿瘤生长

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http://www.nature.com/articles/s41586-018-0387-5

赖氨酸乙酰转移酶介导的组蛋白乙酰化是染色体组装及功能所必需的¹。原癌基因KAT6A和KAT6B属于乙酰转移酶MYST家族（KAT5–KAT8），KAT6A对于正常造血干细胞至关重要，是复发性染色体易位的靶点，可导致急性骨髓性白血病（acute myeloid leukaemia，AML）²；相似地，KAT6B染色体易位存在于多种癌症³。KAT6A通过赖氨酸乙酰转移酶活性调控CDKN2A基因抑制细胞衰老⁴；此外，KAT6A等位基因缺失可使MYC诱导的淋巴瘤小鼠中期生存从105天延长至413天⁵。因此，抑制KAT6A和KAT6B可能有助于癌症治疗。本研究工作者研发针对KAT6A和KAT6B高度特异性的抑制剂，即WM-8041和WM-1119，通过生物化学和结构研究揭示其作用原理，同时在细胞和淋巴瘤小鼠内进一步研究其功能和分子机制。

一知识积累及缩略词

1，β-galactosidase activity：β-半乳糖苷酶活性，细胞衰老的marker，细胞衰老提高其活性；

2，CD19⁺IgM^-：肿瘤B淋巴细胞；CD19⁺IgM⁺：正常脾脏B淋巴细胞；

3，SPR：surface plasmon resonance，即表面等离子共振技术，可用于检测DNA与蛋白质之间、蛋白质与蛋白质之间、药物与蛋白质之间等生物分子之间的相互作用。

4，K_D：equilibrium dissociation constant，解离常数，决定有机化合物在介质中的存在形态，进而决定其溶解度、亲脂性及毒性。对于药物分子，还会影响其药代动力学和生物化学性质。

5，Papp：apparent permeability coefficient，表观渗透系数，判断药物的吸收能力；

6，IC₅₀：half-maximal inhibitory concentration，半数最大抑制浓度；

7，r.m.s.d.：root mean square deviation，均方根偏差。

二实验结果

1，  WM-8041是KAT6A/B的选择性抑制剂并通过与KAT6A/B底物乙酰辅酶A竞争结合发挥抑制功能

在243000个不同的小分子化合物中，经过筛选，研究工作人员确定酰基磺酰肼化合物CTx-0124143是一种竞争性的KAT6A抑制剂，其IC₅₀是0.49μM。CTx-0124143经过药物化学改造产生WM-8041，其IC₅₀是8nM，相当于对KAT6A的抑制活性增加了60倍。此外，CTx-0124143（CTx-143）经过药物化学改造产生非活性化合物WM-2474。CTx-0124143，WM-8041和WM-2474的化学结构如图1a所示。如图1b，WM-8041主要抑制KAT6A和KAT6B活性（IC₅₀分别是8nM和28nM），而对KAT7和KAT5的抑制活性（IC₅₀分别是342nM和224nM）要弱十倍以上；WM-2474对不同的KATs几乎没有抑制作用；CTx-143、WM-8041和WM-2474对KAT8几乎没有抑制作用，对更远距离相关的赖氨酸乙酰转移酶KAT2A、KAT2B、KKAT3A和KAT3B也是如此（如图1b和1c）。因此，WM-8-41是KAT6A/B的选择性抑制剂。

研究工作者解析了MYST组蛋白乙酰转移酶结构域（MYST^Cryst）与WM-8041（1.85 Å）或乙酰辅酶A（1.95 Å）相互作用形成复合体的晶体结构（如图1d-1g），WM-8041占有MYST^Cryst中的乙酰辅酶A结合位点，被封闭在由D685到R704残基形成的α螺旋以及从Q65到G65的环中；乙酰辅酶A与MYST^Cryst形成的复合体呈球状褶皱，r.m.s.d.是0.6 Å，与WM-8041和MYST^Cryst形成的复合体中所有原子排列的r.m.s.d.（0.3 Å）相近；此外，WM-8041和MYST^Cryst结合的氢键与乙酰辅酶A与MYST^Cryst结合的氢键相似。因此，WM-8041直接与乙酰辅酶A竞争结合MYST组蛋白乙酰转移酶的底物结合结构域。

图1 乙酰转移酶MYST家族的抑制剂WM-8041的研发

2，  WM-8041诱导胚胎成纤维细胞MEFs衰老

由于KMAT6A能抑制细胞衰老，研究工作者使用WM-8041处理MEFs检测其能否产生相似的生物学功能。如图2a，与对照组WM-2474相比，WM-8041（IC₅₀为2.4μM）处理MEFs10天后开始抑制细胞增殖，此表型与他莫昔芬（tamoxifen）诱导Cre酶表达敲除KAT6A相似（如图2b）。如图2c，与对照组WM-2474相比，WM-8041处理MEFs6天后导致G0/G1细胞增加，减少G2/M期细胞。研究工作者通过RNA-seq进一步揭示WM-8041可诱导衰老相关分子表达差异，包括Cdkn2a mRNA的上调以及Cdc6的下调（如图2d），且随WM-8041处理时间增加表达差异也增加，其中Cdc6是KAT6A的靶基因²。如图2e，与对照组相比，WM-8041显著提高MEFs的β-半乳糖苷酶活性，即WM-8041诱导细胞衰老。值得注意的是，与对照相比，MEFs在WM-8041处理4天和10天时γ-H2AX表达水平未改变，即G1期细胞阻滞不是DNA损伤引起的，同时提示WM-8041并未引起DNA损伤。此外，如图2f，WM-8041对Trp53敲除的MEFs细胞（Trp53^−/−）产生轻微细胞增殖抑制，对Cdkn2a敲除的MEFs细胞（Ink4a^−/−Arf^−/−）并未产生细胞增殖抑制。因此，WM-8041通过p16I^NK4A–p19^ARF通路诱导细胞衰老，且对细胞没有通常的DNA损伤毒性。

图2 WM-8041诱导MEFs细胞衰老

3，  高浓度WM-8041降低KAT7介导的整体H3K14ac水平

KAT7是全局H3K14ac调控必需的组蛋白乙酰转移酶⁶，而KMT6A主要负责特定靶基因H3K9ac的形成⁷。研究工作者检测了WM-8041（10μM）对全局H3K14ac和H3K9ac的作用，如图3a，WM-8041处理MEFs 5天后对整体的H3K9ac影响不大，但显著降低全局的H3K14ac，且呈一定的浓度依赖性（图3b）。如图3c，RNA-seq展示，与KAT6A野生型MEF细胞（Kat6a^+/+）相比，KAT6A敲除MEFs（Kat6a^−/−）中基因表达差异与WM-8041处理MEFs的基因表达差异具有很强的相关性。缺失KAT6A下调E2f1、Ezh2和Melk²。同样地，WM-8041处理MEFs后显著降低E2f1、Ezh2和Melk mRNA水平（图2d），同时降低这些基因启动子H3K9ac水平（图2e）。因此，高浓度WM-8041降低KAT7介导的整体H3K14ac水平，同时也降低KAT6A介导的特定基因转录起始位点H3K9ac水平。

图3 WM-8041减少细胞特定组蛋白位点的乙酰化

4，  WM-8041衍生物WM-1119能在体抑制淋巴瘤生长

淋巴瘤的发展很大程度上依赖于KAT6A⁵，研究工作者利用肿瘤模型在体评估WM-8041对淋巴瘤的作用。然而，WM-8041在体内时对细胞膜蛋白的高度亲和性限制其向细胞内转移发挥作用，因此，研究工作者对其进行改造产生WM-1119（如图4a），降低其对膜蛋白的结合能力，同时降低对KAT5和KAT7的结合，增加对KAT6A的特异性。为了评估KAT6A抑制剂对淋巴瘤的作用，研究工作者首先在EMRK1184淋巴瘤细胞中检测WM-8041和WM-1119对细胞的作用，如图4b，两者均显著抑制细胞增殖，但WM-1119的IC₅₀为0.25μM，几乎是WM-8041（IC₅₀为2.3μM）的十分之一，即WM-1119作用相对更强。接下里，研究工作者在雄性C57BL/6-albino (B6(Cg)-Tyrc-2J/J)小鼠中通过静脉注射100000个EMRK1184淋巴瘤细胞构建肿瘤动物模型，在注射3天后通过活体成系统检测肿瘤生长情况，然后随机分成WM-1119治疗组和对照组，分别给予WM-1119和空白对照腹腔注射处理，每天4次或3次。如图4d，在10天内， WM-1119治疗组肿瘤小鼠与与空白对照组肿瘤小鼠肿瘤生长差异不明显，但在10天后，WM-1119治疗组肿瘤小鼠的肿瘤开始减小，特别地，WM-1119给予一天4次治疗的肿瘤小鼠在14天时肿瘤得到显著抑制（图4c）。与空白对照组相比，WM-1119治疗组（一天4次治疗）小鼠的脾脏重量显著降低（图4e），但与正常无肿瘤小鼠的脾脏重量无差异（图4f）。流式细胞术分析发现，与空白对照组相比，WM-1119治疗组中肿瘤细胞（CD19⁺IgM^-）明显减少（图4g）。因此，WM-1119可在体抑制淋巴瘤生长。

图4 WM-1119能在体抑制淋巴瘤生长

三讨论与思考

KAT6A/B作为原癌基因，对于肿瘤的发展起着关键的作用。在本研究中，研究工作者研发了针对KAT6A/B的选择性抑制剂WM-8041和WM-1119，这对于今后KAT6A/B相关的基础研究及肿瘤研究提供了新的抑制剂分子。

现将该研究思路整理如下：

Step1：从小分子化合物库初步筛选到KAT6A的抑制剂CTx-0124143；

Step2：药物化学改造CTx-0124143产生抑制能力增强的WM-8041，同时产生无抑制能力的药物WM-2474，以便后续研究中作为对照药物；

Step3：评估WM-8041对赖氨酸乙酰转移酶的特异性；

Step4：检测WM-8041作为药物的理化性质及生物学特性（溶解度、药物代谢、细胞质膜穿透等）

Step5：解析WM-8041与其抑制靶标乙酰转移酶复合体的晶体结构，特别关注底物结合功能域，确定抑制剂发挥功能的机理；

Step6：细胞水平检测WM-8041能否引起与KAT6A相似的细胞衰老表型，验证相关分子，同时检测是否带来通常的细胞毒性（DNA损伤）。

Step7：根据靶标KAT6A的功能（与淋巴瘤发展相关），体内检测抑制剂是否用于治疗淋巴瘤，同时检测药物的代谢动力学及对血液中细胞成分的影响，以及对动物体重等常见生理指标评估，初步判断是否具有向临床转化的可能。

WM-8041具有的优点和不足整理如下：

1，  优点

（1）药物在低浓度时对KAT6A/B活性抑制具有很强的特异性；

（2）在培养基中可稳定存在，便于后续研究；

（3）药物使用未引起DNA损伤；

2，  不足：

（1）在水中溶解度较低（8-16μM）；

（2）在培养基中，具有相对较高的蛋白结合特点，降低了其自由浓度；

（3）对细胞膜蛋白的高度亲和限制了其在活体的应用。

研究工作者通过药物化学改造WM-8041产生WM-1119，在一定程度上克服了其在体的应用，同时更加提高其活性和特异性，但是WM-1119在体使用时，腹腔注射后4~6h，其血药浓度就低于1μM，在后期治疗时就必须增加药物使用频率，但这一不足之处或许可以克服：

（1）药物化学继续改造WM-1119以延长其在体代谢时间；

（2）包载于适当载体制备缓释药以延长其在体代谢时间；

（3）包载于含有目标肿瘤细胞细胞特异的膜表面蛋白对应抗体的载体，实现靶向给药。

参考文献

1. Lee, K.K. & Workman, J.L. Histone acetyltransferase complexes: one size doesn't fit all. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 284-95 (2007).

2. Sheikh, B.N. et al. MOZ (MYST3, KAT6A) inhibits senescence via the INK4A-ARF pathway. Oncogene 34, 5807-20 (2015).

3. Huang, F., Abmayr, S.M. & Workman, J.L. Regulation of KAT6 Acetyltransferases and Their Roles in Cell Cycle Progression, Stem Cell Maintenance, and Human Disease. Mol Cell Biol 36, 1900-7 (2016).

4. Perez-Campo, F.M. et al. MOZ-mediated repression of p16(INK) (4) (a) is critical for the self-renewal of neural and hematopoietic stem cells. Stem Cells 32, 1591-601 (2014).

5. Sheikh, B.N. et al. MOZ regulates B-cell progenitors and, consequently, Moz haploinsufficiency dramatically retards MYC-induced lymphoma development. Blood 125, 1910-21 (2015).

6. Kueh, A.J., Dixon, M.P., Voss, A.K. & Thomas, T. HBO1 is required for H3K14 acetylation and normal transcriptional activity during embryonic development. Mol Cell Biol 31, 845-60 (2011).

7. Voss, A.K. et al. MOZ regulates the Tbx1 locus, and Moz mutation partially phenocopies DiGeorge syndrome. Dev Cell 23, 652-63 (2012).