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摘要
获得性染色体DNA扩增是许多肿瘤的特征。 直接控制位点特异性DNA标记扩增机制尚未明确。尽管组蛋白H3赖氨酸9/36（H3K9 / 36）三脱甲基酶KDM4A的过表达和稳定能产生瞬时位点特异性拷贝数增加（TSSG）。 在这项研究中，作者发现了一系列H3K4修饰染色质调节因子，它们与H3K9和H3K36调节因子共同作用来协调TSSG。H3K4三脱甲基酶KDM5A和特异性COMPASS / KMT2 H3K4甲基转移酶通过H3K4甲基化状态和KDM4A募集来调节不同的TSSG基因座。 此外，独特的染色质修饰物网络MLL1-KDM4B-KDM5B以独立于KDM4A的方式控制特定基因组基因座处的拷贝数调节。
正文
癌细胞具有多种染色体畸变。 跨多种不同肿瘤类型的体细胞拷贝数改变（SCNA）的全基因组研究已经证明，特定染色体区域会表现出更高频率的DNA拷贝数增加和扩增，伴随相关基因表达增加。以前，组蛋白3赖氨酸9/36（H3K9 / 36）三脱甲基酶KDM4A的过表达和稳定化，以及染色质状态的直接调节（即H3K9和K36甲基化），可以导致药物的位点特异性DNA拷贝增加。这些DNA拷贝扩增是染色体外的，在S期发生，并且在细胞周期的晚期S /早期G2阶段丢失。本研究探讨染色质调节剂及其相关的组蛋白修饰状态如何影响位点特异性复制和DNA拷贝增加。 通过对赖氨酸脱甲基酶（KDM）进行小干扰RNA（siRNA）筛选，鉴定出了H3K4三脱甲基酶KDM5A在限制TSSG中的作用。 KDM5A消耗和增加的H3K4me3用作KDM4A募集和相关扩增的信标。 此外，在TSSG中发现了特定MLL / COMPASS H3K4甲基转移酶，KDM5A和KDM4A之间的串扰。 此外，还发现了一个独立于KDM4A的TSSG站点。 该TSSG受到MT2A / MLL1，KDM5B和KDM4B之间错综复杂的相互作用的调节。 这些发现强调了H3K4甲基化在调节TSSG中的关键作用，同时说明了染色质修饰因子和局部表观遗传状态在控制再复制和DNA扩增中有着更广泛的作用。
KDM5A的消耗促进特定位点的复制扩增
作者对所有赖氨酸脱甲基酶家族（KDM1-KDM7）进行了siRNA筛选（图1A）。作者还用另一组实验条件下未经历TSSG的探针，作为阴性对照区域（染色体8着丝粒，8c）（图1B，1C）。作者发现只有KDM5A的消耗导致1q12h拷贝显著增加，而8c显示没有显着变化（图1B，1C）。H2591肺癌细胞在KDM5A消耗后也表现出1q12h拷贝增加（图1D）。 KDM5A的消耗也足以导致其他先前鉴定的TSSG经历拷贝数增加（即1q21.2和Xq13.1），而染色体1和X上的其他区域（即1q23.3,1qTel，Xcen）保持不受影响（图1E）。KDM5i在多个细胞系中引起1q12h拷贝增加的剂量依赖性增加（图1F，1G）。与KDM5A调节TSSG的要求一致，染色质免疫沉淀（ChIP）分析表明，在KDM5A siRNA处理后，TSSG位点的KDM5A显着减少（图1H），这表明KDM5A直接结合这些区域可以抑制拷贝数增加。
KDM5A依赖的拷贝扩增是瞬态的，需要S阶段，并且来自重复复制
为了确定KDM5A依赖性扩增是否是瞬时的，我们洗掉了KDM5i并评估了TSSG（图2A）。在KDM5i处理48或72小时后，RPE细胞产生拷贝增加（无洗脱）;然而，在除去药物后（洗脱24小时，图2B，2C），DNA拷贝增加显着减少。为了确定在S期期间是否产生复制扩增，在接受KDM5i之前，RPE细胞在G1 / S中被羟基脲（HU）处理（图2D）。用HU预处理阻断KDM5i产生DNA拷贝增加（图2E和S2C）。然而，从HU释放的KDM5i处理的细胞产生拷贝增加（图2F），证明KDM5i导致S期依赖性。在纯化基因组DNA并通过聚合酶链式反应（qPCR）定量之前，将每种细胞条件的重 - 重DNA部分合并在一起（图2G）。我们观察到在KDM5A耗尽时复制获得区域1q12h，1q12 / 21,1q21.2和Xq13.1的重 - 重DNA显著富集（图2H）;然而，在1q23.3对照区没有观察到富集。这表明降低的KDM5A水平促进了接受TSSG的部位的重复复制。
KDM5A耗尽促进TSSG生成后S期
作者研究了KDM5A耗尽产生的拷贝扩增是否遵循相同的动力学。在通过DNA FISH分析复制扩增之前，用CDK1抑制剂（CDK1i，Ro-3306）在G2晚期阻止细胞（图2I）。我们观察到由KDM5A消耗产生的TSSG在Ro-3306处理后发生（图2J）。在KDM5A耗尽后，与对照细胞相比，在G2晚期停滞的细胞在重复复制和拷贝获得的基因座处富集了DNA Pola，而非复制的基因座没有DNA Pola富集（图2K）。此外，我们观察到在KDM5A消耗后G2中晚期EdU的显著富集，这表明在G2晚期停滞期间发生DNA合成（图2L）。总之，我们的观察结果支持KDM5A耗尽改变染色质状态的假设，以便在S期期间发生重复复制和复制扩增并持续到G2晚期。
KDM5A相关的复制扩增需要KDM4A
在KDM5A消耗时经历扩增的区域中H3K4me3（图3A）和KDM4A占据（图3B）的水平增加，但不在非拷贝获得的基因座（1q23.3）内（图3A-3B）。 KDM4A的消耗阻断了用KDM5A耗尽或KDM5i处理观察到的DNA拷贝增加（图3C）。 此外，组蛋白H3.3赖氨酸4突变体（H3K4M）的引入消除了由KDM5A耗尽和KDM4A过表达产生的TSSG（图3E-3F）。 这些观察结果说明了将KDM4A招募到经历特定位点重复复制和复制扩增位点的机制。
H3K4KMTs调节正在进行TSSG的特定位点
首先，作者进行了KDM5A和KMT2共耗竭实验以鉴定在TSSG平衡KDM5A调节的酶。然后回复由KDM5A耗尽产生的TSSG的KMT在单独过表达时产生TSSG的能力。通过判定KMT在两种测定中得分，酶直接参与调节位点特异性拷贝增加的可能性增加（图4A）。在经历TSSG的位点之后，H3K4 KMT的特定亚群与KDM5A保持平衡（图4A）。在过表达单个H3K4 KMT之前，我们耗尽了KDM4A（图4B-4I）。在KDM4A消耗后，通过过表达其他H3K4 KMT产生的TSSG被完全或部分拯救（图4B-4I）。例如，KDM4A的耗尽抑制了SETD1B产生1q12h和1q21.2扩增（图4B-4C和4E-4F），但仅部分拯救了由KMT2D过表达产生的1q21.2拷贝增益（图4D）。由KMT2A或KMT2D过表达产生的1q21.3TSSG在KDM4A耗尽时被拯救（图4G-4I）。这些数据强调需要平衡KMT / KDM表达，以便控制位点特异性DNA扩增。
鉴定KDM4A非依赖性TSSG
在研究KDM4A耗尽是否可以抑制每个KMT驱动的拷贝增加时，作者观察到KMT2A过表达导致DNA拷贝增加在1p32.3（图4G）。该区域没有复制KDM4A过表达或KDM5A耗尽导致的扩增（图5A和5B）。针对KDM5家族成员的siRNA筛选则鉴定出KDM5B是1p32.3 DNA拷贝增加的调节剂（图5A和5B）。此外，应用KDM5家族成员的化学抑制则可以产生1p32.3和1q21.3区域的拷贝增加（图5C）。为了确定1p32.3拷贝扩增是否是瞬时的，洗掉KDM5i药物后发现拷贝增加并返回到基线水平（图5D和5E）。然后作者证明了KDM5B过表达可阻断KMT2A产生的1p32.3拷贝增加（图5F），而不干扰KDM5A调节下的其他KMT2A拷贝获得位点（1q21.3）（图5F）。 H3K4M的引入也消除了KDM5B-和KMT2A依赖性1p32.3拷贝增加（图5G-5H）。
1p32.3 DNA拷贝增益需要KDM4B
作者过表达了KDM4A-C家族成员并评估了复制扩增是否发生在1p32.3位点。仅催化活性的KDM4B过表达导致1p32.3拷贝显著增加，而1q12h，1q21.3和1q23.3基因座保持不变（图6A-6C）。此外，KDM4B过表达促进DNA FISH探针覆盖的1p32.3区域内的再复制（图6D）。KDM4A与MCM蛋白和DNA聚合酶相互作用（图6E）。此外，在这些较大复合物中的多个亚基上观察到KDM4B与MCM和DNA聚合酶亚基之间的能量转移程度不同，这表明KDM4B与这些蛋白质复合物结合（图6E）。总之，这些结果表明KDM4B直接与复制机制相关联，以促进1p32.3区域的重复复制和拷贝增加。由于KMT2A以KDM4A依赖性方式促进1p32.3 DNA拷贝增加（图4G），作者研究了KMT2A产生的拷贝的增加1p32.3是否需要KDM4B。 KDM4B耗尽消除了KMT2A产生的1p32.3拷贝增加，证明KDM4B对于KMT2A产生的拷贝增益是必需的（图7A）。 KDM4B也是KDM5B消耗产生的拷贝增加所必需的，而KDM4A消耗对1p32.3拷贝增加没有任何影响（图7B）。与该观察结果一致，用KDM5i处理产生的1p32.3也被KDM4B耗尽阻断（图7C）。此外，H3K4M突变体的引入消除了由KDM4B过表达产生的1p32.3拷贝增加（图7D），这表明染色质上的KDM4B募集通过H3K4甲基化发生。NanoBRET测定证明表达H3K4M的细胞在体内具有与染色质相关的KDM4B减少（图7E和7F）。通过ChIP，作者发现在稳定过表达时，在重复序列位点观察到KDM4B富集（图7G）。引入K9M和K36M可导致1q12h，1q21.2和1q21.3区域的拷贝增加（图7H）。
小结
组蛋白赖氨酸甲基化动力学控制位点存在特异性DNA扩增。H3K4甲基化平衡调节KDM4A靶向复制扩增的位点。赖氨酸甲基化酶 - 去甲基化酶网络指导不依赖KDM4A的拷贝扩增。H3K36甲基化控制位点特异性拷贝增加，是不依赖于H3K9甲基化。
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