摘要
单克隆抗体药物已被证明是非常成功的一类治疗产品。作为一种生物药物，在其生产过程中对整个生产过程的控制是其他化学药物不可比拟的。如何保证在大规模商业化生产中获得安全，有效的产品？工艺的放大环节就显得非常关键。因此，将小规模研发的生产工艺线性放大至中试和大规模商业化生产的能力是单克隆抗体药物工艺开发的关键步骤之一。层析技术作为抗体药物生产的下游工艺的关键步骤，是实现产品所需的纯度和回收率，以及保证产品安全，有效，工艺经济性的基础。本文将阐述在单克隆抗体药物生产中层析工艺成功放大可行性的操作方案及注意事项。
在生物药物的商业化生产中，下游纯化工艺的主要方法通常是大规模的层析纯化。如果选择层析纯化方法，层析工艺的开发通常将涉及不同规模下的层析参数的优化以及层析工艺的放大。层析工艺的放大，在选择层析填料和操作设备方面都面临着独特的挑战，是生物药物成功商业化生产的关键问题。
在小试规模工艺开发阶段将筛选各种填料，以选择合适的层析填料作为目标产品与杂质分离的基础。一旦确定了层析填料，下一个阶段将是设计特定的层析工艺，通过调节样品和缓冲液的条件，层析工艺参数优化，达到优化产品纯度和回收率的目的。确定了层析工艺运行条件后，接下来要解决的问题则是如何将层析工艺适当的放大至大规模商业化生产所需的水平。从小试规模到中试级别需要50-100倍的放大，从中试级别到商业化生产规模需要10-50倍的放大。在层析工艺的放大过程中需要考虑多种层析和非层析的因素，这些因素在层析工艺的放大中发挥着重要的作用。
一个可行性的层析工艺放大操作方案可包含四个步骤，1. 层析工艺参数的线性放大；2. 层析工艺设备的选择；3. GAP FEMA分析；4. 层析工艺放大的确认。
所谓线性放大，是指从实验室规模到中试结果或者工业生产级别，可以得到几乎一致的层析效果。层析工艺参数的线性放大一般通过增加层析柱直径和体积流速来实现，同时确保填料的柱床高度和线性流速保持不变，这样就能保证在样品在小规模和大规模层析柱上的总保留时间是恒定的。理论上，这种线性放大的纯化分离行为应该是非常相似的，从而能够保证层析工艺成功的放大。
表1 层析工艺参数放大的基本原则
固定不变 | 柱床高度 |
线性流速 | |
样品的组成（浓度和条件） | |
样品体积/柱体积比 | |
洗脱液体积/柱体积比 | |
缓冲液条件 | |
可放大 | 柱直径 |
体积流速 | |
样品体积 | |
缓冲液体积 | |
额外考虑的因素 | 柱管支撑力的下降（压力降增大） |
柱效/柱床的不稳定性 | |
样品的扩散（峰展宽） | |
系统及管道的死体积 |
层析系统
大规模商业化生产所用的层析系统通常是自动化系统。其使用一系列的管道，入口阀，流量计，气泡检测器，空气陷阱和压力传感器等实现层析工艺的自动化运行。大规模层析系统与小试规模层析系统相比，往往会死体积增加，从而导致样品的稀释，出峰展宽，降低层析工艺的分辨率。因此，从小试规模到商业化生产规模，选择一致的层析系统将大大降低层析工艺放大过程的风险。如果选择不一致的层析系统，则在放大规模上，通常需要进一步修正先前优化的工艺参数。GE可提供从小试规模，到中试以及商业化生产规模的层析系统，并且具有统一的Unicorn软件操作平台，可成功实现线性放大，无需进行工艺参数的再次优化（图1）。
图1 GE层析系统，从小试规模到商业化生产规模
层析柱
层析柱的选择需要考虑的因素有：层析柱的尺寸和材质，层析柱与层析系统和层析填料的匹配性以及层析柱操作的难易程度。层析柱的尺寸可以根据小试规模确定的层析工艺参数以及层析工艺的回收率计算的层析填料使用量来确定。层析柱常用的材质有玻璃，丙烯酸和不锈钢，使用不同材质的层析柱需要考虑其溶出物/浸出物，以及对层析填料清洁试剂的耐受性。随着层析柱直径的增加，层析柱的装填也变困难。为减少人为装填所带来的误差，采用可自动化装柱的层柱，可有效增加层析柱放大的成功率。GE最新一代的Axichrom 最新一代智 能装填层析柱，采用轴向压缩的 方式（图2）， 提供了预设程序和经校准的填充方法，确保了准确、可重复的填充结果，降低了对专业人员的需 求，并促进产品更快转换; 由互动式指令支持更简单和安全的操 作 ; 稳健和可放大基础上简单实现技术无缝转移，并且有专门清洁设计支持清洁验证。
图2 Axichrom层析柱装柱示意图
图3 不同直径层析柱与层析系统的匹配性
层析填料
虽然在小试规模就进行了层析填料的筛选，但是小试规模的工艺开发往往会忽略层析填料内在的固有稳定性，即物理和化学稳定性。层析柱柱床的不稳定性往往是由于层析填料物理性能较差引起，而化学稳定性则会影响层析填料清洗过程配基的脱落。良好的物理和化学稳定性是层析填料成功放大的基础。
为满足产品申报过程的监管审查，层析填料作为一种关键的原材料，需要提供完整的验证文档和法规支持文件。新一批的填料在进入生产周期之前还需要相应的质量检测文件。对于单克隆抗体药物等治疗性生产药物，使用无动物来源的材料以及经过验证的生产制造技术也是监管机构所规定的。大规模的商业化生产还应考虑层析填料能够充分以及及时的供给，以免造成商业化生产的中断。
GAP analysis，即缺口分析，是用来对两种不同的系统间的差别进行研究的工具。Failure Modes and Effects Analysis （FEMA），失效模式与效应分析，是质量风险管理工具的一种，可以用来评估生产过程的风险，并采取措施进行风险控制。结合GAP分析和FEMA，可以对层析工艺放大的每个阶段进行风险评估，对于存在风险的步骤，则需要采取降低风险的措施。GAP FEMA分析可大大降低层析工艺放大过程的风险，提高层析工艺放大成功率。
确认层析工艺放大是否成功可以从以下几个方面进行判断：层析图谱的一致性，层析工艺的回收率以及产品的纯度，层析工艺去除杂质（产品相关杂质和工艺相关杂质）的性能是否与小试规模一致。如果层析放大判断指标出现不一致，则需要对放大后的层析工艺参数进行微调，以确定最终的放大后层析工艺条件。
图4 使用GE层析系统与层析柱进行层析工艺放大的层析图谱重叠图
近年来，由于工程细胞系的建立，细胞培养基的改善和生物反应器控制的革新，单克隆抗体药物的批次补料培养规模可达到>20,000L，细胞表达量可达到5-10 g/L。下游纯化也需要适应上游生产规模的改变，采用合理的层析工艺放大原则，进行层析工艺的放大。表2为一个经典的单克隆抗体药物不同规模阶段的层析工艺参数与层析柱的选择。这个结果既符合线性放大的原则，同时又进行了技术和商业两个 层面的考量，是一个层析工艺成功放大的案例。
表2 单克隆抗体药物层析工艺放大的一个案例
上游细胞培养技术的不断发展，对单克隆抗体药物制造商开发可靠，可重复的下游纯化工艺提出了严峻的挑战。层析技术在下游纯化工艺中起着关键作用，是单克隆抗体药物能否成功商业化生产的关键因素。只有当层析工艺进行了合理的设计才能有效的实现其成功放大。一个成功的层析工艺放大操作方案则包括层析工艺参数的线性放大，层析设备的合理选择，GAP FEMA分析以及放大的确认和参数微调。GE的层析填料，层析系统和层析柱经过了严格而细致的设计，在精心筹备的硬件设备的基础建立起平稳，顺利的放大程序，可有效保证产品质量，节约整体成本，及时获得市场认可。
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