Bioprocess Insights | 连续生物工艺之灌流培养基的选择

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生物工艺干货

连续生产在食品和化学药品生产上已经被使用多年，因为其高效、快速和更稳定的特性近些年越来越被制药行业所关注。FDA一直倡导和鼓励制药企业应用更有效的制药工艺，其中就包括鼓励制药企业使用连续生产作为提高治疗效果的有效方式之一。小编不才，也想就此将分作几期和各位小伙伴一起探讨一下连续生物工艺。今天奉送给大家的是此系列第一篇：

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主题：上游工艺灌流培养基的选择

灌流培养的概述

随着单克隆抗体药物产业的发展，人们通过不断的改进设备和生产工艺从而提高单抗产量和质量。目前，传统的补料培养在工业生产中仍占有主导地位，而对于一些不稳定或对产品质量有特殊要求的蛋白，灌流培养则有利于维持产物的质量。灌流培养可以通过提高细胞密度和优化培养环境，从而提高产物的产量，可以减小设备的尺寸和提高单位体积的产率。

灌流培养的模式

早期的灌流培养主要应用于贴壁细胞，包括中空纤维膜生物反应器和固定床（Disc）等。

现阶段在单抗和重组蛋白生产中，主要采用悬浮细胞的灌流培养，利用高效的截留设备可以大大提高细胞密度，中空纤维的系统甚至可以同时兼具澄清过滤或者超滤的作用，主要的截留系统包括超声截留、TFF和ATF等装置。

超声截留装置末端开放（图1），依靠超声波进行截留，该装置无法完全截留所有细胞，理论上可以无限期培养，国内已有超过300天的案例。 

    图1 BioSep         图2 TFF              图3 ATF

TFF（Tangential Flow Filtration，图2）和 ATF（Alternating Tangential Flow，图3）为中空纤维系统示意图。利用中空纤维系统均可以将密度提高到2×10^8/ml以上，表达量可达50g/L以上。

灌流培养基的选择

在灌流培养的过程中，如何平衡产品（产量/质量）与培养基用量这是大家研究的主要课题，选择合适的培养基才能体现出灌流培养的最大优势。目前灌流培养基主要包括：商品化、自有配方以及由生产商专门定制的培养基。

目前已有的灌流培养项目中，使用的商品化培养基有CHO-S-SFM II、SFM4CHO、CDM4PerMab和ActiPro（添加Cell boost5或7）等；GE已经跟客户合作利用商品化培养基HyCell 和ActiPro开发了多项灌流细胞培养项目。

我们在选择合适的灌流培养基时，通常经过以下步骤：

a.

先做基础培养基筛选，挑选表现最好的基础培养基；

b.

设置不同的单位细胞的灌流速率(CSPR, cell-specific perfusion rate)，每个CSPR维持培养3-5天；

c.

进行上清分析确认主要营养成分的消耗情况，通过添加一定比例的补料，最终形成灌流培养基；

d.

在实际灌流培养中验证并进一步优化基础培养基与补料的比例和灌流速率。

实际案例

利用ActiCHO™ platform（ActiCHO P medium, ActiCHO Feed A and ActiCHO Feed B）培养基在WAVE™ 25 system上进行灌流培养基的优化。

 Perfusion with

 steady-state conditions

step 1

图4 Illustration of experimental strategy

 in steady-state approach

用ActiCHO P进行灌流培养，研究细胞在不同的CSPR时培养液中的营养成分变化，在每个CSPR时维持3天后进行取样检测。

Spent media analysis and

 new medium design

Step 2

取样进行上清分析，可看到氨基酸等营养成分的比例变化，通过添加一定比例的补料来优化灌流培养基。

案例中根据ActiCHO Feed A和ActiCHO Feed B的营养成分，最终确定在ActiCHO P中添加7%的ActiCHO Feed A和1%的ActiCHO Feed B作为灌流培养基。

Medium verification in perfusion

Step 3

图5 Perfusion run at 1 RV/d to determine the maximum performance

用灌流培养基进行培养确认，灌流速率设定为1 RV/d（Reactor Volume/day），根据培养的结果，选取蓝色部分作为最佳的操作窗口（cv>50 MVC/mL，CSPR≈20 pL/c/d，qP≈30 pcd）进行稳态培养确认。

 Confirmation under steady-state

Step 4

图6 Steady-state conditions at CSPR=20 pL/c/d

灌流速率维持在1 RV/d的情况下，通过定期排出细胞，使密度维持在50MVC/ml左右，罐内条件达到相对的稳态，在允许的范围内延长培养时间，最大限度利用培养基和硬件设备，使利益最大化。

总结

随着生物制药行业的发展，灌流培养越来越被大家接受，而随着设备和培养基的不断升级，灌流培养在很多方面体现出其优越性，将在生物制药行业发挥重要的作用。